大鼠谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表達(dá)與鑒定

李 敏,閔偉勇,張 舟

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,沈陽(yáng) 110016)

0 引 言

Na+依賴的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sodium-coupled Neutral Amino Acid Transporters,SNATs)屬于SLC38基因家族.根據(jù)功能特性和調(diào)控模式,SLC38家族分為System A和System N兩個(gè)亞型,其中SNAT1、SNAT2、SNAT4屬于System A;SNAT3、SNAT5屬于System N[1-4].SNAT1和SNAT3是SLC38家族中首先發(fā)現(xiàn)的Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4-6].除了SNAT4外,SLC38家族中的成員均偏愛(ài)轉(zhuǎn)運(yùn)L-谷氨酰胺[1].

谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是人血漿中濃度最高的氨基酸[7],系統(tǒng)性的Gln缺乏將引起多系統(tǒng)疾病和致命的多器官功能衰竭[8].作為蛋白質(zhì)的組成成分之一,Gln在胚胎的生長(zhǎng)過(guò)程中有著多重作用[9].它參與了檸檬酸循環(huán)、核苷酸和蛋白質(zhì)的生物合成以及氨代謝,也是神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)和抗氧化劑谷胱甘肽的前體物質(zhì)[10].在大腦和肝臟中,由谷氨酰胺合成酶合成Gln是氨代謝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11].Gln通過(guò)谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)為大腦興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的合成提供底物,參與大腦能量代謝,直接關(guān)系到大腦的興奮性和抑制性調(diào)控[12-13].胎盤中也存在谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán),Gln從胎盤釋放進(jìn)入胎兒的血液循環(huán),提供胎兒生長(zhǎng)所需的氨基酸[14-15].Gln發(fā)揮以上這些作用均離不開(kāi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助,而在Gln的攝取和釋放過(guò)程中,SLC38家族的成員SNAT3扮演著關(guān)鍵角色.

SNAT3由SLC38A3基因編碼,主要定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜上[4,16],為 System N中的標(biāo)志性成員.SNAT3對(duì)pH敏感[17],它通過(guò)反向轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)H+的方式共轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸[4,18-20].研究發(fā)現(xiàn),SNAT3和SNAT5共同起作用,在大腦中參與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán),介導(dǎo)Gln從星形膠質(zhì)細(xì)胞輸出[5,16,20-21],這是膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的關(guān)鍵一步.已有報(bào)道表明,SNAT3是Gln從星形膠質(zhì)細(xì)胞輸出的主要推動(dòng)者[4,19].在伯格曼神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(BGC)中,SNAT3和GLAST/EAAT1相互作用,介導(dǎo)Gln的輸出[22],這一生理過(guò)程也可以為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的生物合成提供Gln[23-24].SNAT3通過(guò)介導(dǎo)Gln的輸出還參與了大腦、肝臟的氨解毒過(guò)程[4,5,25],以及大鼠腎臟的酸中毒反應(yīng)[26].SNAT3在分離的人類原始滋養(yǎng)層細(xì)胞中也有表達(dá),表達(dá)量會(huì)隨后者分化成合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞而降低;胚胎發(fā)育早期,SNAT3可為胚胎提供Gln,并隨妊娠的進(jìn)展,其表達(dá)水平呈顯著下降的趨勢(shì)[7].

鑒于SNAT3在各種生理和病理活動(dòng)中的重要性,深入探索SNAT3的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義.目前,將一些標(biāo)簽蛋白與目的蛋白構(gòu)建在一起,通過(guò)標(biāo)簽蛋白與目的蛋白的融合共表達(dá)來(lái)研究蛋白質(zhì)的表達(dá)與定位的方法受到了越來(lái)越多研究者的親睞.綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)最早從維多利亞水母體內(nèi)克隆得到,大小為27 kDa,它在藍(lán)光或紫外光的激發(fā)下可產(chǎn)生清晰明亮的綠色熒光,且熒光有抗光漂白作用,很容易與自身熒光區(qū)別.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)是一種優(yōu)化的GFP的突變體,與GFP相比具有更強(qiáng)的熒光信號(hào),是一種通用的分子標(biāo)簽.

本研究采用三片段連接的方法將EGFP連接到了真核生物表達(dá)載體pBK-CMVΔ-SNAT3中SNAT3的N端,構(gòu)建了pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒,通過(guò)檢測(cè)EGFP而檢測(cè)SNAT3的表達(dá)和定位.結(jié)果表明,EGFP-SNAT3融合蛋白能在HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá)并正確定位于細(xì)胞膜上,為檢測(cè)SNAT3在細(xì)胞膜上的表達(dá)與定位提供了一種新而有效的研究工具,并為今后進(jìn)一步研究SNAT3的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒,菌種和細(xì)胞株

pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT2和pBK-CMV(Δ[1098-1300])-SNAT3(以下簡(jiǎn)稱pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT2和pBK-CMVΔ-SNAT3)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司;人體胚腎細(xì)胞(HEK293T/17,ATCC number CRL 11268)購(gòu)自中科院生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù).

1.1.2 工具酶和生化試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI-HF、EcoRI-HF、SacI、T4 DNA Ligase、CIP(去磷酸化酶)購(gòu)自美國(guó)NEB公司;2×Taq MasterMix,無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.25%Trypsin-EDTA(1×)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;Cocktail蛋白酶抑制劑(PI)購(gòu)自美國(guó)Roche公司;兔源抗GFP多克隆抗體,鼠源抗GAPDH單克隆抗體,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L) 抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體購(gòu)自中科英沐公司;GeneRulerTM1 kb DNA Ladder(SM0311/2/3)和PageRuler Prestained Protein Ladder(SM0671/2)購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司 ;RIPA裂解液和Pierce?BCA Protein Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo公司.本研究所用引物由上海生工生物工程有限公司合成,測(cè)序由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成.

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

利用NEBcutter V2.0在線軟件工具查得pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒中的單酶切位點(diǎn)BamHI、EcoRI和SacI,分別以pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT2和pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒為模板,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物(表1).由于進(jìn)一步克隆的需要,在擴(kuò)增EGFP的上下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI的酶切序列,在擴(kuò)增SNAT3的上下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI的酶切序列.應(yīng)用Taq MasterMix通過(guò)PCR擴(kuò)增EGFP和SNAT3基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收.

表1 PCR擴(kuò)增基因的引物序列(5′-3′)

1.2.2 pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

PCR擴(kuò)增得到的EGFP和SNAT3基因片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化.EGFP進(jìn)行BamHI-HF和EcoRI-HF雙酶切反應(yīng);SNAT3進(jìn)行EcoRI-HF和SacI雙酶切反應(yīng);pBK-CMVΔ-SNAT3載體質(zhì)粒進(jìn)行BamHI-HF和SacI雙酶切反應(yīng),并用堿性磷酸酶CIP去磷酸化1 h.分別對(duì)雙酶切回收好的EGFP、SNAT3和載體大片段進(jìn)行濃度測(cè)定,按照3∶3∶1的摩爾比在16 ℃下用T4 DNA Ligase連接10 h.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,鋪含Kan(30 μg/mL)的瓊脂平板,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h后挑取大腸桿菌單菌落接種于含Kan(30 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中,放入37 ℃搖床270 r/min條件下進(jìn)行搖菌培養(yǎng),并通過(guò)菌液PCR(引物見(jiàn)表1)初步鑒定.提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)酶切和測(cè)序獲得序列正確的pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒.

1.2.3 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)

分別收集pBK-CMVΔ-SNAT3和pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染36 h后的HEK293T細(xì)胞,用預(yù)冷的RIPA裂解液裂解細(xì)胞后,于4 ℃,1 500 r/min,離心15 min,收集上清液,即總蛋白.將上清液于4 ℃,35 000 r/min,離心30 min,棄上清后用蛋白重懸液(40 mmoL/L Tris-Hcl pH7.4,5 mmoL/L Mgcl2,0.4 mmoL/L EGTA)重懸沉淀即得膜蛋白.用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度.取20 μg總蛋白和20 μg膜蛋白用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1.5 h后用兔源抗GFP多克隆抗體(1∶6 500)和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 500)各孵育1.5 h,通過(guò)放射自顯影檢測(cè)EGFP-SNAT3融合蛋白的表達(dá).同時(shí)用鼠源抗GAPDH單克隆抗體(一抗1∶3 000)檢測(cè)GAPDH作為對(duì)照.

1.2.4 轉(zhuǎn)染和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染前,HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(DMEM+10%FBS,5% CO2),待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí),用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞中,同時(shí)轉(zhuǎn)染pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒作為對(duì)照.質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000的比例為1∶3.轉(zhuǎn)染36 h后,用Leica激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察熒光并拍照.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3的構(gòu)建

圖1為正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒示意圖,由CMV promoter啟動(dòng)EGFP-SNAT3融合基因在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá).分別以pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT2和pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒為模板,用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得EGFP和SNAT3基因片段.瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物與EGFP和SNAT3的預(yù)期大小一致(圖2A),分別約為729 bp和936 bp,陰性對(duì)照無(wú)條帶.用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI對(duì)pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切,獲得一個(gè)大小約為5 692 bp的載體大片段和一個(gè)1 051 bp的小片段,電泳證實(shí)其大小正確(圖2B).

圖1 重組質(zhì)粒pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3(7 345 bp)圖譜

A:1:DL 10000 DNA Marker; 2:EGFP基因; 3:陰性對(duì)照; 4:SNAT3基因; 5:陰性對(duì)照; B:1:DL 10000 DNA Marker; 2:pBK-CMVΔ-SNAT3大片段(5 692 bp)和小片段(1 051 bp).

將PCR擴(kuò)增得到的EGFP和SNAT3基因片段雙酶切產(chǎn)物與載體大片段連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,利用Kanr篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落,并用不同引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行菌液PCR初步鑒定(圖3A),獲得了729、930和1 659 bp左右的片段,分別與EGFP、SNAT3和EGFP-SNAT3的大小一致.菌液PCR結(jié)果表明EGFP和SNAT3基因片段已連接到了pBK-CMV載體上.

提取質(zhì)粒DNA后,通過(guò)酶切對(duì)pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒做進(jìn)一步驗(yàn)證(圖3B).不同的酶切反應(yīng)分別得到了大小約為5 692、930和723 bp的片段,長(zhǎng)度分別與載體大片段、SNAT3和EGFP相符合.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,EGFP和SNAT3基因片段已插入到載體大片段中.經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定后,對(duì)獲得的重組質(zhì)粒pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3進(jìn)行DNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證明其序列完全正確.

2.2 EGFP-SNAT3融合蛋白的表達(dá)鑒定

2.2.1 Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)

將pBK-CMVΔ-SNAT3質(zhì)粒和構(gòu)建好的pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞36 h后,收集細(xì)胞,用RIPA裂解法提取總蛋白,并在總蛋白的基礎(chǔ)上用高速離心法進(jìn)一步提取膜蛋白.通過(guò)10%SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜,利用抗GFP多克隆抗體檢測(cè)EGFP-SNAT3融合蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá),同時(shí)用抗GAPDH單克隆抗體檢測(cè)GAPDH作對(duì)照.EGFP-SNAT3的融合蛋白的理論大小為82 kDa,Western blot結(jié)果顯示的目的蛋白在55～90 kDa之間和40 kDa,對(duì)照組中總蛋白和膜蛋白均未見(jiàn)任何特異性條帶(結(jié)果見(jiàn)圖4),由此可以說(shuō)明EGFP-SNAT3在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞膜上正常表達(dá)和定位.

A:1:DL 10000 DNA Marker; 2:PCR擴(kuò)增片段(引物EF、ER); 3:PCR擴(kuò)增片段(引物SF、SR); 4:PCR擴(kuò)增片段(引物EF、SR); B:1:DL 10000 DNA Marker; 2:BamHI/EcoRI/SacI三酶切pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3; 3:BamHI/EcoRI雙酶切pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3; 4:EcoRI/SacI雙酶切pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3; 5:BamHI/SacI雙酶切pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3; 6:pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3.

1:pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的總蛋白; 2:pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的膜蛋白; 3:對(duì)照:pBK-CMVΔ-SNAT3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的總蛋白; 4:對(duì)照:pBK-CMVΔ-SNAT3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的膜蛋白.

2.2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)

用pBK-CMVΔ-SNAT3和pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,取轉(zhuǎn)染36 h后的培養(yǎng)皿在Leica LSCM下觀察EGFP-SNAT3融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和定位.觀察結(jié)果顯示,在細(xì)胞膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上均分布有綠色熒光(圖5),說(shuō)明重組質(zhì)粒pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3構(gòu)建成功,并在HEK293T細(xì)胞中正常表達(dá),同時(shí)證明EGFP-SNAT3融合蛋白定位于細(xì)胞膜上.對(duì)照組未見(jiàn)任何熒光.

3 討 論

SLC38家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及疾病治療中表現(xiàn)出關(guān)鍵作用,引起了很多科研工作者對(duì)這一家族成員的關(guān)注和投入.對(duì)SLC38家族的研究已經(jīng)持續(xù)了40多年,主要探求其在基因調(diào)控和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中所承擔(dān)的生理學(xué)角色[27].該家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白現(xiàn)已被認(rèn)為是腫瘤形成過(guò)程中的治療靶點(diǎn)[1,28].本研究中在SLC38家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SNAT3的N端加入了EGFP標(biāo)簽,成功構(gòu)建了pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒,既可以用商業(yè)化的GFP多克隆抗體間接檢測(cè)SNAT3的表達(dá),又可以通過(guò)LSCM觀測(cè)熒光的方法直接確定SNAT3在細(xì)胞膜上的表達(dá)和定位.將熒光蛋白與目的蛋白基因融合共表達(dá)來(lái)研究蛋白質(zhì)的相關(guān)特性具有重要的生物學(xué)意義.GFP作為一種基因標(biāo)志在生命科學(xué)研究中有著無(wú)限潛力,它與目的蛋白基因相融合后既能保持目的蛋白原有的活性,又不影響自身的發(fā)光能力,從而使之作為一種通用的融合分子標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的位置、活性和相互作用研究以及活細(xì)胞體內(nèi)的示蹤研究,并取得了較好的效果.目前,將免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的表達(dá)定位、結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性等方面的研究方法也正在被很多科研工作者采用.Wang等[29]利用間接免疫熒光法確定了人類乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);有報(bào)道應(yīng)用免疫組化和免疫共沉淀的方法闡明了SNAT3在BGC細(xì)胞中的表達(dá)定位及其在BGC細(xì)胞Gln釋放過(guò)程中的生理學(xué)作用[22].

A:對(duì)照:pBK-CMVΔ-SNAT3轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞; B:pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞.

與已有SNAT3結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)研究中使用的方法不同,本研究首先采用PCR擴(kuò)增和酶切連接技術(shù)將EGFP、SNAT3基因片段克隆到了真核生物表達(dá)載體pBK-CMV(Δ[1098-1300])中,從而構(gòu)建了EGFP-SNAT3融合表達(dá)基因.實(shí)驗(yàn)中用菌液PCR、酶切以及DNA測(cè)序3種方法對(duì)重組質(zhì)粒的構(gòu)建進(jìn)行了鑒定,并最終獲得了EGFP正確連接于SNAT3上游的重組質(zhì)粒pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3.通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)和Western blot技術(shù)證實(shí)了EGFP-SNAT3融合蛋白能夠在細(xì)胞中表達(dá)并正確定位于細(xì)胞膜上,其分子量大小為82 kDa,介于70 kDa和100 kDa之間.Western blot結(jié)果顯示,在目的蛋白條帶下方出現(xiàn)了兩條特異性條帶,第一條分子量大小在55 kDa和70 kDa之間,第二條在40 kDa左右,推測(cè)其可能是EGFP-SNAT3融合蛋白的N端在翻譯及翻譯后加工過(guò)程中形成的產(chǎn)物.Western blot結(jié)果顯示的蛋白條帶比較彌散的原因可能是該融合蛋白為糖蛋白或者是部分蛋白發(fā)生了降解.

目前,闡明SLC38家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一些生理和病理過(guò)程中的功能、動(dòng)力學(xué)特性和調(diào)控模式方面的材料日漸積累,但關(guān)于其結(jié)構(gòu)和更多生物學(xué)意義方面的報(bào)道尚不多見(jiàn).已有的研究預(yù)測(cè)了SNAT3的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),顯示其具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,N端在細(xì)胞內(nèi)側(cè)而C端位于細(xì)胞外側(cè)[30].pBK-CMVΔ-EGFP-SNAT3重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建在為檢測(cè)SNAT3在細(xì)胞膜上的表達(dá)和定位提供一條新途徑的同時(shí),也為今后結(jié)合免疫學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)或定點(diǎn)突變等技術(shù)深入研究SNAT3的精細(xì)結(jié)構(gòu)和潛在的生物學(xué)功能提供借鑒,進(jìn)而為臨床診斷和疾病治療提供依據(jù).

參考文獻(xiàn):

[1] MACKENZIE B,ERICKSON J D.Sodium-coupled neutral amino acid(System N/A) transporters of the SLC gene family[J].Pflugers Arch-Eur J Physiol,2004,447:784-795.

[3] SHOTWELL M A,JAYME D W,KILBERG M S,et al.Neutral amino acid transport systems in Chinese hamster ovary cells[J].J Biol Chem,1981,256(11):5422-5427.

[4] CHAUDHRY F A,REIMER R J,KRIZAJ D,et al.Molecular analysis of system N suggests novel physiological roles in nitrogen metabolism and synaptic transmission[J].Cell,1999,99(7):769-780.

[5] GU S,RODERICK H L,CAMACHO P,et al.Identification and characterization of an amino acid transporter expressed differentially in liver[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3230-3235.

[6] VAROQUI H,ZHU H,YAO D,et al.Cloning and functional identification of a neuronal glutamine transporter[J].J Biol Chem,2000,275(6):4049-4054.

[7] YOSHIKA C,YASUDA S,KIMURA F,et al.Expression and role of SNAT3 in the placenta[J].Placenta,2009,30(12):1071-1077.

[8] HABERLE J,GORG B,TOUTAIN A,et al.Inborn error of amino acid synthesis:human glutamine synthetase deficiency[J].J Inherit Metab Dis,2006,29(2-3):352-358.

[9] BELL A W,KENNAUGH J M,BATTAGLIA F C,et al.Uptake of amino acids and ammonia at mid- gestation by the fetal lamb[J].Q J Exp Physiol,1989,74(5):635-643.

[10] ALEDO J C,GóMEZ-FABRE P M,OLALLA L,et al.Identification of two human glutaminase loci and tissue-specific expression of the two related genes[J].Mamm Genome,2000,11(12):1107-1110.

[11] SUáREZ I,BODEGA G,FERNáNDEZ B.Glutamine synthetase in brain:effect of ammonia[J].Neurochem Int,2002,41(2-3):123-142.

[12] ROTHMAN D L,BEHAR K L,HYDER F,et al.In vivo NMR studies of the neurotransmitter flux and neuroenergetics:implications for brain function[J].Annu Rev Physiol,2003,65:401-427.

[14] CETIN I,DE SANTIS M S,TARICCO E,et al.Maternal and fetal amino acid concentrations in normal pregnancies and in pregnancies with gestational diabetes mellitus[J].Am J Obstet Gynecol,2005,192(2):610-617.

[15] BATTAGLIA F C.Glutamine and glutamate exchange between the fetal liver and the placenta[J].J Nutr,2000,130(4S Suppl):974S-977S.

[16] NAKANISHI T,SUGAWARA M,HUANG W,et al.Structure,function,and tissue expression pattern of human SN2,a subtype of the amino acid transport system N[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,281(5):1343-1348.

[17] SIDORYK M,OBARA M,ALBRECHT J.Selective decrease of SN1(SNAT3) mRNA expression in human and rat glioma cells adapted to grow in acidic medium[J].Neurochem Int,2006,48(6-7):547-552.

[18] BR?ER A,ALBERS A,SETIAWAN I,et al.Regulation of the glutamine transporter SN1 by extracellular pH and intracellular sodiumions[J].J Physiol,2002,539(Pt 1):3-14.

[19] CHAUDHRY F A,KRIZAJ D,LARSSON P,et al.Coupled and uncoupled proton movement by amino acid transport system N[J].EMBO J,2001,20(24):7041-7051.

[20] NAKANISHI T,KEKUDA R,FEI Y J,et al.Cloning and functional characterization of a new subtype of the amino acid transport system N[J].Am J Physiol,2001,281(6):C1757-C1768.

[21] CUBELOS B,GONZáLEZ-GONZáLEZ I M,GIMéNEZ C,et al.Amino Acid Transporter SNAT5 Localizes to Glial Cells in the Rat Brain[J].GLIA,2005,49(2):230-244.

[22] MARTíNEZ-LOZADA Z,GUILLEM A M,FLORES-MéNDEZ M,et al.GLAST/EAAT1-induced Glutamine release via SNAT3 in Bergmann glia cells:evidence of a functional and physical coupling[J].J Neurochem,2013,125(4):545-554.

[23] BOULLAND J L,OSEN K K,LEVY L M,et al.Cell-specific expression of the glutamine transporter SN1 suggests differences in dependence on the glutamine cycle[J].Eur J Neurosci,2002,15(10):1615-1631.

[24] BOULLAND J L,RAFIKI A,LEVY L M,et al.Highly differential expression of SN1,a bidirectional glutamine transporter,in astroglia and endothelium in the developing rat brain[J].Glia,2003,41(3):260-275.

[25] FEI Y J,SUGAWARA M,NAKANISHI T,et al.Primary structure,genomic organization,and functional and electrogenic characteristics of human system N1,a Na+and H+coupled glutamine transporter[J].J Biol Chem,2000,275(31):23707-23717.

[26] KARINCH A M,LIN C-M,WOLFGANG C L,et al.Regulation of expression of the SN1 transport during renal adaptation to chronic metabolic acidosis in rats[J].Am J Physiol,2002,283(5):F1011-F1019.

[27] VAN WINKLE L J,CAMPIONE A L,GORMAN J M.Na+independent transport of basic and zwitterionic amino acids in mouse blastocysts by a shared system and by processes which distinguish between these substrates[J].J Biol Chem,1988,263(7):3150-3163.

[28] SCHI?TH H B,ROSHANBIN S,HGGLUND M.Evolutionary origin of amino acid transporter families SLC32,SLC36 and SLC38 and physiological,pathological and therapeutic aspects[J].Molecular Aspects of Medicine,2013,34(2-3):571-585.

[29] WANG H,LEE E W,CAI X,et al.Membrane topology of the human breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2) determined by epitope insertion and immunofluorescence[J].J Biol Chem,2008,47(52):13778-13787.

[30] SCHNEIDER H P,B?ER S,BROER A,et al.Heterologous expression of the glutamine transporter SNAT3 in xenopus oocytes is associated with four modes of uncoupled transport*[J].J Biol Chem,2007,282(6):3788-3798.