中晚期肝癌肝動(dòng)脈栓塞化療是否聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法的療效比較

曹 亮，李 偉，盛 俊，彭 勛，彭 勇，郭聰珊，田 茹

中晚期肝癌肝動(dòng)脈栓塞化療是否聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法的療效比較

曹 亮1，李 偉1，盛 俊1，彭 勛1，彭 勇2，郭聰珊2，田 茹2

目的觀察肝動(dòng)脈栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法對中晚期肝癌的近期療效，以及對外周血T淋巴細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。方法回顧分析114例中晚期原發(fā)性肝癌患者實(shí)行TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法(研究組)或單一TACE治療(對照組)的資料。研究組(56例)全部經(jīng)過TACE術(shù)且術(shù)后第2天接受過繼T細(xì)胞回輸；對照組(58例)僅接受TACE治療。治療為每4周一次，最多不超過3次，觀察療程為2年。觀察無進(jìn)展生存期(progress free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)，以及治療前后相同時(shí)間點(diǎn)測定T淋巴細(xì)胞亞群、Treg細(xì)胞以及AFP計(jì)數(shù)變化。結(jié)果研究組與對照組的近期療效及AFP下降率比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究組治療后6個(gè)月、1年、2年的無進(jìn)展生存率分別是71.4%、23.2%、5.4%；對照組分別是65.5%、31.0%、3.4%。兩組中位疾病進(jìn)展時(shí)間分別是8個(gè)月(95%CI，8-11個(gè)月)和5個(gè)月(95%CI，6-9個(gè)月)。研究組治療后6個(gè)月、1年、2年的總生存率分別是89.2%、71.4%、60.7%，對照組分別是70.6%、41.4%、17.2%。兩組中位生存期分別是18個(gè)月(95% CI，16-20個(gè)月)和11個(gè)月(95% CI，9-13個(gè)月)。研究組CD4+細(xì)胞比率由治療前(51.27±4.85)%升至(54.51±5.03)%，CD8+以及Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)分別由(40.87±3.26)%和(6.36±0.98)%下降至(37.24±3.56)%和(3.89±0.31)%，CD4+/CD8+比值增大(P<0.05)；對照組治療后與治療前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論中晚期肝癌患者TACE術(shù)后聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法可提高無進(jìn)展生存期和總生存期，并能提高免疫能力，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)，有可能降低中晚期肝癌患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。

原發(fā)性肝癌；肝動(dòng)脈化療栓塞；過繼T細(xì)胞療法；無進(jìn)展生存期；總生存期；T淋巴細(xì)胞亞群；Treg細(xì)胞

原發(fā)性肝癌已成為世界范圍內(nèi)的第五大腫瘤[1]，是我國腫瘤導(dǎo)致死亡的第二大原因。早期原發(fā)性肝癌的治療方法首選手術(shù)治療和肝移植，據(jù)報(bào)道，只有20%的原發(fā)性肝癌患者從中受益[2]。由于大部分肝癌患者就診時(shí)多屬于中晚期，已喪失了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，對這類患者的治療國內(nèi)外已經(jīng)把肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)確定為最佳非手術(shù)治療手段之一。然而，應(yīng)用TACE仍然有不能消滅腫瘤細(xì)胞和難以控制腫瘤復(fù)發(fā)的局限性[2-6]。

自體初始型T細(xì)胞(Na?ve T細(xì)胞)是過繼細(xì)胞療法的主要細(xì)胞來源，在體外由初始型T細(xì)胞制備效應(yīng)性抗原特異性T細(xì)胞的程序與初始型T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成效應(yīng)性T細(xì)胞的體內(nèi)生理過程基本一致。此療法是利用每個(gè)原發(fā)性肝癌患者自身的DC細(xì)胞誘導(dǎo)出具有其自身肝癌細(xì)胞抗原特異性T細(xì)胞，使肝癌患者個(gè)體化治療成為可能[7]，其免疫優(yōu)勢是對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有持久性和特異性。Diego等[8]研究表明，聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法治療原發(fā)性肝癌小鼠模型，12個(gè)月存活率可達(dá)到100.0%，腫瘤消失率可達(dá)到100.0%，并且肝癌無復(fù)發(fā)。

本研究通過回顧114例中晚期原發(fā)性肝癌患者，主要評(píng)估TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法對中晚期肝癌患者的短期療效、免疫功能、無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS) 的影響。

1 資料與方法

1.1 資料 選擇我院從2007-01至2012-12收治的年齡超過18歲，經(jīng)病理或臨床證實(shí)且病例資料完整的不能手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌患者114例，且實(shí)行TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法或單一TACE治療?；颊咭话銧顩r良好，ECOG評(píng)分0～2分，其中103例(90.4%)HBsAg陽性，所有患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均>3.0×1012，血小板計(jì)數(shù)>100×109，腫塊直徑為4～10 cm，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有患者按照2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期為Ⅱ期或Ⅲa或Ⅲb期；Child-Pugh A級(jí)103例(90.3%)，B級(jí)11例(9.6%)。依據(jù)患者意愿，56例患者接受TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法，作為研究組。另58例患者僅接受TACE治療，作為對照組。全部患者治療前均簽署知情同意書。兩組患者治療前60 d均未接受任何放化療或影響免疫功能的藥物。研究組男50例，女6例，平均(52.0±4.1)歲；對照組男50例，女8例，平均(51.0±3.4)歲。兩組病例臨床分期及腫瘤分級(jí)等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

1.2 儀器和主要試劑 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(珠海市再鑫儀器有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。流式細(xì)胞抗體：CD3單克隆抗體、CD4單克隆抗體、CD8單克隆抗體、淋巴細(xì)胞分離液、白細(xì)胞因子，均為美國ABCAM公司產(chǎn)品。培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿均為Corning公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 TACE 采用Seldinger穿刺插管技術(shù)，局部麻醉，經(jīng)皮右股動(dòng)脈穿刺，導(dǎo)管選擇至腫瘤供血?jiǎng)用}行DSA造影，根據(jù)腫瘤血供情況進(jìn)行栓塞。TACE藥物選擇吡柔比星30～50 mg，喜樹堿5 mg，碘化油10～20 ml，碘海醇5～10 ml。每4周治療1次，最多不超過3次。

1.3.2 過繼T細(xì)胞制備 抽取40 ml患者外周富集血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，用含10%人AB型血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～3)×106/ml，放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第1天加入人重組白介素(IL-1α)100 U/ml、人重組干擾素(IFN-γ)100 U/ml，培養(yǎng)第2天加入人重組IL-2 500 U/ml，第4天、第5天分別加腫瘤壞死因子(TNF)3000 U/ml。每3 d更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d后，收獲細(xì)胞，50%回輸給患者，同日抽取患者40 ml外周血，加入剩余50%細(xì)胞中再次培養(yǎng)7 d，方法同上。

1.3.3 過繼T細(xì)胞回輸 治療組在TACE術(shù)當(dāng)天回輸?shù)?次培養(yǎng)的過繼T細(xì)胞給患者，細(xì)胞數(shù)在(0.01～1)×108，整個(gè)回輸過程保持在30 min內(nèi)完成。30 d為一療程，1年不超過4個(gè)療程。

1.4 療效評(píng)價(jià) 檢測研究組與對照組治療前1周及治療后2周患者外周血AFP、T淋巴細(xì)胞(CD4+、CD8+)和CD4+、CD25+Treg細(xì)胞等免疫指標(biāo)水平的變化。療效評(píng)價(jià)依據(jù)CT或MRI 檢查，確定腫瘤縮小的程度，根據(jù)WHO實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)療效，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)，客觀有效率為CR+PR。計(jì)算無進(jìn)展生存率和總生存率。

2 結(jié) 果

2.1 近期療效 治療后，研究組56例中，CR、PR、SD和PD分別為 8、40、5和3例；對照組58例中，分別為4、30、18和6例。研究組有效率85.7%，高于對照組有效率58.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群及Treg細(xì)胞的變化 研究組治療后與治療前相比，CD4+T細(xì)胞增多，CD8+T細(xì)胞減少，CD4+/CD8+比值增大，Treg細(xì)胞減少(P<0.05)；而對照組患者治療后與治療前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

注：與治療前比較，①P<0.05；與對照組比較，②P<0.05

2.3 隨訪 平均隨訪時(shí)間為24個(gè)月(6～33個(gè)月)。114例均死亡，死亡原因?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝衰竭、上消化道大出血。研究組6個(gè)月、1年和2年無進(jìn)展生存率和總生存率與對照組進(jìn)行對比，研究組的無進(jìn)展生存率和總生存率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。

注：與對照組比較，①P<0.01

2.4 不良反應(yīng) 研究組(56例患者)治療后1周內(nèi)出現(xiàn)疼痛20例次(35.7%)，發(fā)熱12例次(21.4%)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少3例次(5.3%)，肝功能損害0例次(0%)，不良反應(yīng)共計(jì)35例次(62.5%)；對照組(58例患者)中出現(xiàn)疼痛35例次(60.3%)，發(fā)熱20例次(34.5%)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少6例次(10.3%)，肝功能損害2例次(3.4%)，共計(jì)63例次(108.6%)；研究組的不良反應(yīng)發(fā)生率低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述不良反應(yīng)經(jīng)過對癥處理后均緩解或消失。

3 討 論

原發(fā)性肝癌在治療上，通常采取手術(shù)、放療、化療、介入治療、直線加速器、伽馬刀、射頻消融術(shù)、中醫(yī)等療法，但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率低。半個(gè)世紀(jì)以來，世界各國肝癌的發(fā)病率和病死率都呈現(xiàn)增高的趨勢，到目前為止，肝癌的治療效果仍不滿意。雖然手術(shù)和肝移植仍是肝癌的首選治療方法，但由于大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，而且肝源缺乏也限制了肝移植的實(shí)施。

目前TACE最常用于肝癌的治療，包括肝動(dòng)脈插管化療栓塞和肝動(dòng)脈插管化療灌注。TACE作為不可切除晚期肝癌的的首選治療方法，在世界范圍內(nèi)已得到了廣泛運(yùn)用，并取得了較好療效。由于大部分原發(fā)性肝癌的血供來源于肝動(dòng)脈，所以TACE可使化療藥物在腫瘤組織首次濃度達(dá)到100%。然后，部分藥物經(jīng)過靶器官靜脈回流進(jìn)入體循環(huán)，這時(shí)相當(dāng)于藥物從靜脈注入，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡[9]。研究發(fā)現(xiàn)，TACE法也有缺陷，TACE的缺點(diǎn)就在于不能完全殺死肝癌細(xì)胞。肝癌患者均具有免疫缺陷，這與肝癌不易控制甚至易復(fù)發(fā)也有很大關(guān)系。

本研究應(yīng)用TACE療法聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法，即應(yīng)用栓塞、化療與免疫聯(lián)合療法，對中晚期肝癌的近期療效，以及外周血T淋巴細(xì)胞亞群和Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了觀察和分析。結(jié)果顯示，TACE后聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法與單純TACE治療法比較，中晚期肝癌的近期療效、無進(jìn)展生存期以及總生存期均有提高(P<0.05)，表明TACE后聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法對于中晚期肝癌的治療效果優(yōu)于單純TACE治療法。AFP是原發(fā)性肝癌的高特異性和高靈敏度的腫瘤標(biāo)志物，肝癌患者的AFP常常明顯升高。但是，在本研究中兩組AFP下降率相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能原因是大約80%成人的肝癌血清AFP才出現(xiàn)升高，而且腫瘤與腫瘤標(biāo)志物之間只是一種相關(guān)性的關(guān)系，并不是一一對應(yīng)的關(guān)系，也就是說，肝癌狀況的變化不一定引起AFP的明顯改變。

根據(jù)《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》，CD4+T細(xì)胞減少或CD8+T細(xì)胞增多可見于惡性腫瘤。CD4+/CD8+比值是免疫調(diào)節(jié)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，正常值1.4～2.0，若其比值<1.4可見于惡性腫瘤。在本研究中，研究組患者治療后與治療前相比，CD4+T細(xì)胞增多、CD8+T細(xì)胞減少、CD4+/CD8+比值增大且>1.4、Treg細(xì)胞減少(P<0.05)；而對照組患者治療后與治療前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，研究組的療效優(yōu)于對照組，TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞免疫療法具有較好的治療作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，Treg浸潤多和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的高表達(dá)是肝癌患者預(yù)后差的反映，與肝癌疾病進(jìn)展有關(guān)[10，11]。如果應(yīng)用小劑量的化療藥物清除腫瘤微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞(主要是Treg細(xì)胞)，可以增加抗肝癌患者的療效[12]。由此可以解釋TACE后聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法可以提高患者的近期療效、無進(jìn)展生存期和總生存期，本課題結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。另外，從臨床觀察來看，TACE術(shù)后采用過繼免疫T細(xì)胞療法的肝癌患者耐受性好，不良反應(yīng)小。

從免疫學(xué)方面看，在固有的NK與NKT細(xì)胞有一定的殺傷癌細(xì)胞的作用，但是徹底清除癌細(xì)胞，需依靠抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)[13，14]，未來良好而有效的過繼細(xì)胞療法的免疫細(xì)胞必須來自T細(xì)胞[15]。TACE能夠清除局部腫瘤本身，過繼T細(xì)胞免疫療法又能夠清除機(jī)體殘留的微小病灶。這兩種方法結(jié)合，既針對了局部腫瘤的治療又改善了抑制性免疫微環(huán)境，可達(dá)到個(gè)體化全身治療的目的。

總之，本研究表明，TACE聯(lián)合過繼T細(xì)胞療法，在短期內(nèi)可以提高機(jī)體抗腫瘤的免疫能力，從而提高了患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。

[1] Parkin D M, Bray F, Ferlay J,etal. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000 [J]. Cancer, 2001, 94(2): 153-156.

[2] Achenbach T, Seifert J K, Pitton M B,etal. Chemoembolization for primary liver cancer [J]. Eur J Surg Oncol, 2002, 28(1): 37-41.

[3] Mizoe A, Yamaguchi J, Azuma T,etal. Transcatheter arterial embolization for advanced hepatocellular carcinoma resulting in a curative resection: report of two cases [J]. Hepatogastroenterology, 2000, 47(36): 1706-1710.

[4] Llovet J M, Real M I, Montana X,etal. Arterial embolisation or chemoembolisation versus symptomatic treatment in patients with unresectable hepatocellular carcinoma: a randomised controlled trial [J]. Lancet, 2002, 359(9319): 1734-1739.

[5] Li L, Wu P H, Li J Q,etal. Segmental transcatheter arterial embolization for primary hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 1998, 4(6): 511-512.

[6] Chen M S, Li J Q, Zhang Y Q,etal. High-dose iodized oil transcatheter arterial chemoembolization for patients with large hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(1): 74-78.

[7] Matar P, Alaniz L, Rozados V,etal. Immunotherapy for liver tumors: present status and future prospects [J]. J Biomed Sci, 2009, 16(30): 1-18.

[8] Avella D M, Li G, Schell T D,etal. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model [J]. Hepatology, 2012, 5(1): 141-152.

[9] Lo C M, Ngan H, Tso W K, Liu C L,etal. Randomized controlled trial of transarterial lipiodol chemoembolization for unresectable hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2002, 35(5): 1164-1171.

[10] Wang F M, Jing X, Li G,etal. Foxp3+ regulatory T cells are associated with the natural history of chronic hepatitis B and poor prognosis of hepatocellular carcinoma [J]. Liver Int, 2012, 32(4): 644-655.

[11] Pedroza-Gonzalez A, Verhoef C, Ijzermans J,etal. Activated Tumor-Infiltrating CD41 Regulatory T Cells Restrain Antitumor Immunity in Patients with Primary or Metastatic Liver Cancer [J]. Hepatology, 2013, 57(1): 183-194.

[12] Imai H, Saio M, Nonaka K,etal. Deletion of CD4+CD25+regulatory T cells enhance interleukin-2-induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma [J].Cancer Sci, 2007, 98(3): 416-423.

[13] Correale P, Botta C, Cusi M Getal. Cetuximab ± chemothrapy enhances dendritic dcell-mediated phagocytosis of colon cancer cells and ignites a highly efficient colon cancer antigen-specific cytotoxic T-cell response in vitro [J]. Int J Cancer, 2012, 130(7): 1577-1589.

[14] Wolpoe M E, Lutz E R, Ercolini A M,etal. HER-2/neu-secific monoclonal antibodies collaborate with HER-2/neu-targeted granulocyte macrophage colony-stimulating factor secreting whole cell vaccination to augment CD8+T cell effector function and tumor-free survival in Her-2/neutransgenic mice [J]. J Immunol, 2003, 171(4): 2161-2169.

[15] Dudley M E, Wunderlich J R, Robbins P F.etal. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes [J]. Science, 2002, 298 (5594): 850-854.

(2013-11-11收稿 2014-02-14修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

WhetherthesystemictranscatheterarterialchemoembolizationoughttocombinewithadoptiveTlymphocytesfortheadvanced-stagehepatocellularcarcinoma:acomparativestudy

CAO Liang1, LI Wei1, SHENG Jun1, PENG Xun1, PENG Yong2, GUO Congshan2, and TIAN Ru2. 1. Department of Medical Oncology, Qinhuangdao No.3 Hospital, Qinhuangdao 066000, China; 2. Department of Biomedical Engineering, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, China

ObjectiveTo study the different affects of TACE alone and TACE combined with adoptive T lymphocytes on the peripheral T lymphocyte subsets and Treg cells for advanced hepatocellular carcinoma(HCC).Methods114 patients with advanced stage HCC were recruited, 56 patients were treated with TACE followed by adoptive T lymphocytes treatment，and 58 patients were treated with TACE only as a control group. Each patient was treated once a month, successive 3 times were a course of treatment. The duration of the observation was 2 years. The progress free survival(PFS) and overall survival(OS), serum levels of AFP, T lymphocyte sunsets and Treg cells in peripheral blood of advanced HCC patients were found out before and after the treatments.ResultsThe short-term responses in the 2 groups were similar. There was also no significant difference in the reduction rates of AFP between these two groups. The 6 months, 1 year, and 2 years PFS rates were 71.4%, 23.2%, 5.4% in combination group, and 65.5%, 31.0%, 3.4% in control group. The median TTP (time to progression)was 8 months (95% confidence interval CI，8-11 months) for combination group and 5 months(95% confidence interval CI，6- 9 months) for control group. The proportion of 6 months, 1 year, and 2 years OS were 89.2%, 71.4% and 60.7% in combination group, while in control group they were 70.6%, 41.4%, 17.2%(P<0.05) , respectively. The median survival time was 18 months(95% CI，16-20 months)in combination group and 11 months(95% CI，9-13 months)in control group. In the study group, the percentage of CD4+increased from(51.27±4.85)% to(54.51±5.03)% (P<0.05), CD8+and Treg cells decreased from (40.87±3.26)%，(6.36±0.98)% to (37.24±3.56)%,(3.89±0.31)% (P<0.05), respectively. The rates of CD4+/CD8+increased greatly(P<0.05). There was no significant difference compared between before and after treatment in the control group.ConclusionsAdjuvant immunotherapy with adoptive T lymphocytes may prolong the PFS and OS in advanced HCC patients, and there is a statistically significant difference. It can improve immunological status as well as the efficacy of TACE in these patients. It may also play an important role in reducing the recurrence and metastases in HCC patients.

hepatocellular carcinoma; transcatheter arterial chemoembolization; adoptive T lymphocytes; progression free survival; overall survival; T lymphocyte subset; Treg cells

秦皇島市2012年科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2012023A217)

曹 亮，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：drcaol@hotmail.co.uk

1. 066000，秦皇島市第三醫(yī)院腫瘤科; 2. 066004秦皇島, 燕山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系

彭 勇，E-mail：PY81@sina.com

R735.7