神經(jīng)壞死病毒在赤點石斑魚組織中的分布

劉曉丹胡先勤黃劍南翁少萍王文文陳文捷秦真東董星星周 洋劉小玲姬 偉張學(xué)振郭志勛何建國林 蠡,,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070; 2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510275;

3. 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070; 4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300; 5. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

神經(jīng)壞死病毒在赤點石斑魚組織中的分布

劉曉丹1胡先勤1黃劍南2翁少萍2王文文1陳文捷1秦真東1董星星1周 洋1劉小玲1姬 偉1張學(xué)振3郭志勛4何建國2林 蠡1,3,5

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070; 2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510275;

3. 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070; 4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300; 5. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

研究采用地高辛原位雜交和免疫熒光檢測技術(shù)分別檢測病毒 RNA2和衣殼蛋白在患病赤點石斑魚Epinephelus akaara稚魚中分布。地高辛檢測結(jié)果表明病毒RNA2主要分布在腦、脊髓、視網(wǎng)膜和鰓上; 免疫熒光檢測結(jié)果和地高辛檢測結(jié)果一致, 表明病毒靶器官主要也是腦、脊髓、視網(wǎng)膜和鰓。腸道中幾乎檢測不到陽性信號, 可能不是病毒的靶器官。因此可以推測神經(jīng)壞死病毒感染赤點石斑魚的主要途徑是鰓, 而不是腸道。

神經(jīng)壞死病毒; 赤點石斑魚; 地高辛原位雜交; 免疫熒光; 組織分布

病毒性疾病嚴重危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展, 近年來我國學(xué)者報道了不少新生病毒性疾病[1—4], 其中病毒性神經(jīng)壞死癥(Viral nervous necrosis virus, VNN)是一種在世界范圍內(nèi)流行的魚類疾病。VNN流行在中國、日本、澳大利亞、英國、加拿大、挪威等國家, 可造成30多種重要經(jīng)濟魚類的大規(guī)模死亡, 嚴重危害著魚類養(yǎng)殖業(yè)[5], 因此該病毒是國際水產(chǎn)病害研究的熱點。神經(jīng)壞死病毒分類上屬于野田病毒科(Nodaviridae), 乙型野田病毒屬(Betanodavirus)。病毒粒子直徑約30—40 nm, 二十面體, 無囊膜, 由衣殼和兩條正單鏈 RNA基因組RNA1和RNA2組成[6]。其中RNA1編碼病毒RNA聚合酶和非結(jié)構(gòu)蛋白B2。RNA2編碼病毒唯一的衣殼蛋白。在光學(xué)顯微鏡下, 患病魚類在腦部和視網(wǎng)膜有明顯空泡, 故又稱病毒性腦膜炎和視網(wǎng)膜病[7,8]。在透射電鏡下可觀察到患病魚腦、視網(wǎng)膜細胞質(zhì)中存在大量病毒粒子[7,8]。

神經(jīng)壞死病毒嚴重危害我國經(jīng)濟魚類, 特別是石斑魚的養(yǎng)殖。2001年中國率先報道了赤點石斑魚Epinephelus akaara病毒性神經(jīng)壞死癥[9], 隨后開展組織病理[10]、流行病學(xué)[11]、衣殼蛋白的克隆和表達[12—14]、全基因組測定[15]等研究。我國其他學(xué)者也做大量研究, 主要包括病理學(xué)[16], RT-PCR檢測方法[17—19]、全基因組測定[20]、流行病學(xué)[21,22]、免疫保護[23]、致病性[24,25]、新細胞株建立[26]、基因干擾載體等[27]。地高辛雜交和免疫熒光檢測技術(shù)可分別檢測病毒核酸和蛋白在患病組織中的分布, 為病毒的感染和復(fù)制提供重要信息。至今為止國內(nèi)還缺乏此類基礎(chǔ)資料。我們團隊曾建立地高辛標(biāo)記DNA探針原位雜交技術(shù)[28]; 本文采用地高辛標(biāo)記 DNA探針和NNV衣殼蛋白特異性抗體, 研究NNV核酸和蛋白在患病赤點石斑魚稚魚組織中分布, 探討了此病毒的感染途徑和復(fù)制位點, 為防治此病提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

赤點石斑稚魚為廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心所生產(chǎn), 全長0.3—0.5 cm, 孵化后20d—30d?；疾◆~苗體彎曲、體色較黑、身體失衡、浮于水面、間或螺旋狀游動, 為典型病毒性神經(jīng)壞死病癥狀(圖1)。用赤點石斑神經(jīng)壞死病毒特異性引物對稚魚腦部總RNA做 RT-PCR檢測, 患病魚樣品呈陽性, 健康魚樣品呈陰性。

圖1 患病赤點石斑稚魚(示體色異常)Fig. 1 Juveniles of red-spotted grouper with abnormal body color

1.2 組織切片

用10%中性福爾馬林固定稚魚。魚苗先經(jīng)透蠟固定, 然后在70%的酒精中處理2h, 80%酒精中2h, 90%酒精中2h, 95%酒精中1h, 100%酒精中1h, 100%酒精中3次每次0.5h, 酒精和二甲苯比例為3︰1溶液中0.5h, 純二甲苯中2次每次0.5h, 58℃石蠟中透蠟 2h, 然后將樣品和石蠟置于冰上, 降溫凝固。將透蠟固定后的組織進行切片, 厚度為 0.4—0.5 μm,自然風(fēng)干。

1.3 PCR 引物名稱和序列

根據(jù)神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因序列(NC 008041.1)設(shè)計三條引物: F1 (5′-GGATTTGGACGTG CGACCAA-3′), R3 (5′-CGAGTCAACACGGGTGAA GA-3′), F2 (5′-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3′)。其中F1和R3用于擴增RNA2編碼衣殼蛋白的T2片段(875 bp), F2和R3用于擴增RNA2編碼衣殼蛋白的T4片段(426 bp)[29]。T2片段的3′和T4片段完全重疊。

1.4 地高辛探針制備

取患病魚苗的頭部(包括眼睛), 用 TRIZOL (Life Technologies) RNA抽提試劑盒, 按照使用說明進行RNA抽提。用F2-R3引物合成T4片段來制備地高辛探針。先將提純的 RNA在沸水中煮 5min, 然后置于冰上5min。取1 μL上述RNA, 加入事先配制好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中, 每一反應(yīng)液含有(5×First strand buffer 2 μL, 0.1 mol/L DDT 1 μL, 2.5 mmol/L dNTP mixture 4 μL, R3引物(20 pmol) 0.5 μL, 核酸酶抑制劑(Life Technologies) 0.1 μL, SUPERSCRIPTTMⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies) 0.2 μL, 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的蒸餾水 1.2 μL), 在 42℃中反應(yīng)30min, 99℃中10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。將上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物稀釋70倍, 采用Boehringer Mannheim 公司生產(chǎn)的地高辛試劑盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit )生產(chǎn)探針。PCR反應(yīng)液: vial3 buffer 5 μL, vial2 buffer 5 μL,引物F2 (20 pmol)0.5 μL, 引物R3 (20pmol) 0.5 μL, vial1(聚合酶)0.75 μL, 稀釋的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5 μL, 加蒸餾水到 50 μL, 先 95 ℃, 2min, 然后30個循環(huán), 循環(huán)條件為95 ℃, 10s; 60 ℃, 30s; 72 ℃ , 3min;最后在72℃延長7min, 4℃中10min。反應(yīng)產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖膠中電泳, 溴化乙錠染色, 照相記錄結(jié)果。

1.5 地高辛探針特異性檢測

采用神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因引物F1和R3擴增T2片段(875 bp), F2和R3擴增T4片段(426 bp)。用地高辛標(biāo)記探針對上述產(chǎn)物進行雜交, 以確認其特異性。取神經(jīng)壞死病毒特異性擴增PCR片段T2和T4, 在2%瓊脂糖膠中120 V電泳1h。對電泳膠用蒸餾水泡洗 3次, 每次 30s。在搖床上(50 r/min)將電泳膠置于變性液中處理 30min, 再用蒸餾水浸泡3次, 每次30s。在中性緩沖液中浸泡15min, 然后用濕法將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜。隨后用2×SSC浸泡 10min, 在 80℃中處理 2h。將尼龍膜浸泡于9.5 mL預(yù)雜交液中68 ℃ , 1h。將地高辛探針在沸水中熱變性10min, 置于冰上5min, 取2 μL探針加到1 mL雜交液中, 充分混合。將尼龍膜浸泡于含有探針的雜交液中, 密封避光 68℃雜交 6h。隨后用2×SSC, 0.1% SDS (w/v) 25 mL洗2次, 每次5min。用0.1×SSC, 0.1%SDS (w/v) 20 mL洗2次, 每次15min。將尼龍膜置于空氣中干燥。用地高辛核酸檢測試劑盒進行檢測如下。用 Buffer I (1 mol/L Tris·HCl, 1.5 mol/L NaCl, pH 7.5), 0.3% Tween20 (w/v) 洗1min, 然后用25 mL Buffer II (0.5% 阻斷劑溶解于Buffer I中)洗30min, 用5 mL Buffer2按1︰5000的比例稀釋vial3(抗地高辛耦聯(lián)抗體), 在室溫中培育30min。然后用15 mL Buffer1洗2次, 每次15min, 用 5 mL Buffer III (0.1 mol/L Tris·HCl, 1.5 mol/L NaCl, pH 9.5, MgCl250 mmol/L)浸泡2min。在新鮮配制的顯色液2.5 mL處理12h, 然后用10 mL Buffer IV (100 mmol/L Tris·HCl, 10 mmol/L EDTA, pH8.0), 洗5min, 顯色、照相記錄結(jié)果。

1.6 組織切片的地高辛檢測

切片先在 60℃中烘 45min, 然后進行脫蠟和復(fù)水: 在純二甲苯中處理2次, 每次10min; 50%二甲苯、50% 酒精混合液中處理5min; 依次在100%和95% 乙醇中各處理2次, 每次2min; 在80%、70%和 50% 酒精中各處理一次, 每次 3min, 最后在蒸餾水中復(fù)水3min。用蛋白酶K在37℃中消化2min,用0.4%甲醛固定5min。將地高辛探針在沸水中熱變性10min, 立即置于冰上5min, 然后混合在1 mL雜交液中。將雜交液加到切片上, 密封避光于 42℃雜交 12h。漂洗與顯色: 在 2×SSC 溶液[0.05% N-lauroylsarcosine (w/v), 0.01 % SDS (w/v), 0.4%封閉液]中 37℃處理2次, 每次5min; 1×SSC溶液中37℃處理2次, 每次5min; 0.5×SSC溶液中37℃處理2次, 每次5min; 0.1×SSC溶液中37℃處理2次,每次5min, Buffer I 中25℃處理5min; Buffer II 中37℃處理 15min; 在 37℃中, 用地高辛耦聯(lián)抗體培育1h(Buffer II按1︰3000倍稀釋抗體); 在25℃用Buffer I洗2次, 每次5min; 用Buffer III在25℃中洗5min; 用 Buffer III稀釋 NBT/BCIP顯色液(濃度為 20 μL/mL), 在 25℃中避光雜交過夜。隨后在Buffer IV中25 ℃ 洗15min; 蒸餾水洗3min, 封片。用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果, 拍照。

1.7 免疫熒光檢測

切片先在純二甲苯中處理2次, 每次5min; 然后依次在100%、90% 和70% 酒精中各處理2min,最后在蒸餾水中復(fù)水 2次, 每次 1min。用 1×PBS (137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 m mol/L Na2HPO4, 1.8 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)洗3次, 每次5min; 用0.1%的蛋白酶K在37℃中處理10min, 用0.4%甲醛固定5min, 用1×PBS洗3次, 每次5min,用兔抗擬 鲹神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白血清(日本森廣一郎博士惠贈)1︰100稀釋, 在37℃孵育30min, 用1× PBS洗3次, 每次5min。用山羊抗兔Ig G耦聯(lián)FITC血清抗體(1︰36), 在 37℃中孵育 30min, 用1×PBS洗3次, 每次5min, 用60% 封片專用甘油進行封片, 熒光顯微鏡觀察, 拍片。

2 結(jié)果

圖2 地高辛探針的制備和特異性檢測Fig. 2 Preparation of DNA probe labeled with digoxigenin (DIG) and its specificity

2.1 探針的制備和特異性檢測

采用RT-PCR法, 擴增病毒衣殼蛋白T4片段。因為反應(yīng)中用DIG-dUTP代替TTP來制備地高辛探針, DIG-dUTP分子量比TTP大, 因此地高辛探針的分子量也比T4 (426 bp)大(圖2a)。為了檢驗探針的特異性, 對病毒衣殼蛋白T2 和T4 兩段DNA進行雜交。結(jié)果表明探針和2個片段都有雜交。從圖中可以看出, 雖然PCR條帶T2在溴化乙錠染色的信號強于T4 (圖2b), 但是地高辛信號T4強于T2(圖2c), 這是因為地高辛探針序列和 T4完全一致, 和T2只有49%的同源。另外, DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子沒有和探針雜交, 這些結(jié)果表明地高辛探針具有很高的特異性(圖2 c)。

2.2 組織切片的地高辛檢測

圖 3 赤點石斑魚稚魚的地高辛原位雜交檢測 (箭頭示陽性反應(yīng), a-e 為感染稚魚; f為健康魚)Fig. 3 DIG-in situ hybridization results of the juvenile of redspotted grouper (positive signal was shown by arrow, a-e were from infected juvenile; f was from non-infected juvenile)

根據(jù)堿基互補配對原則, 標(biāo)記有 DIG的 DNA片段可以和病毒基因組RNA2雜交。因此地高辛探針可以檢測病毒在體內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄狀況。雜交陽性顯色為黃色到紫褐色, 顏色越深, 病毒RNA含量越高。根據(jù)圖 3結(jié)果, 患病石斑魚稚魚的腦部、脊髓、視網(wǎng)膜和鰓上皮細胞內(nèi)可以觀察黃色到紫褐色,其中以腦部和視網(wǎng)膜內(nèi)層脈絡(luò)膜細胞顏色最深, 甚至連成一片。在肝細胞內(nèi)也可觀察分散的褐色顆粒,但是在腸道中幾乎沒有檢測到陽性信號。作為陰性對照, 健康石斑魚稚魚相應(yīng)的組織沒有明顯的黃褐色, 圖3f顯示陰性對照視網(wǎng)膜的檢測結(jié)果。因此, 病毒主要在腦部、視網(wǎng)膜和鰓上皮細胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。

2.3 免疫熒光法檢測

免疫熒光的第一抗體為兔抗神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白血清, 因此其檢測信號代表病毒衣殼蛋白在組織中的分布。衣殼蛋白可以來自病毒粒子, 也可以來自沒有組裝成病毒粒子的蛋白。陽性反應(yīng)呈綠色熒光, 衣殼蛋白越多, 綠色熒光越強。圖4表示, 患病石斑魚稚魚的腦部、脊髓、視網(wǎng)膜和鰓上皮細胞內(nèi)可以觀察到強綠色熒光, 在肝細胞內(nèi)只是較弱熒光, 在腸道幾乎沒有檢測到陽性信號。作為陰性對照, 健康石斑魚稚魚相應(yīng)的組織沒有明顯的綠色熒光, 圖4G顯示陰性對照視網(wǎng)膜的檢測結(jié)果。因此, 病毒粒子主要分布在感染稚魚的腦部、視網(wǎng)膜和鰓上皮細胞內(nèi), 或者在這些器官內(nèi)進行病毒蛋白的翻譯。

3 討論

本文采用地高辛探針和免疫熒光法分別檢測病毒核酸和衣殼蛋白在感染稚魚中的分布。兩種檢測方法檢測到病毒在感染稚魚體內(nèi)的分布一致。病毒核酸和衣殼蛋白在腦、脊髓、視網(wǎng)膜、鰓上都有大量的分布, 肝臟中有少量分布, 在腸道組織中幾乎沒有分布。雖然病毒在肝臟中有少量分布, 但是其分布是分散點狀, 沒有連成一片, 而且并不導(dǎo)致肝臟細胞的空泡化壞死。為什么病毒感染只導(dǎo)致神經(jīng)和視網(wǎng)膜的空泡化壞死, 其機理還不清楚, 需要進一步探索。Chi等[30]采用地高辛探針對石斑魚苗進行組織分布檢測, 結(jié)果表明, 腦、視網(wǎng)膜、鰓、肝、腸和心臟的血細胞中均有分布, 并認為鰓和腸道可能是病毒的入侵途徑。根據(jù)本實驗的結(jié)果, 腸道中幾乎沒有檢測到病毒的核酸和衣殼蛋白信號, 因此腸道是否為傳播途徑, 值得探討。鰓上皮可以檢測到強的陽性信號, 有理由認為鰓是病毒的主要感染途徑。當(dāng)然, 本文的研究結(jié)果也不能排除還有其他的傳播途徑, 比如通過皮膚等, 這需要進一步研究。有趣的是, Chi等[30]采用RT-PCR法血檢測到病毒存在于石斑魚幼魚的血液中, 并認為病毒在體內(nèi)可以通過血液傳播到其他器官, 在疾病的發(fā)生上具有重要意義。由于稚魚的血液采集比較困難, 本文無法提供這方面的信息, 需要進一步探討。

神經(jīng)壞死病毒的感染途徑和復(fù)制研究是重要的基礎(chǔ)信息[31]。各國學(xué)者對病毒的聚合酶、衣殼蛋白、B2蛋白的功能進行了研究[32—34], 為病毒的致病機理提供了基礎(chǔ)資料。此外, 最近研究認為病毒可以存在于受精卵的卵膜內(nèi), 碘試劑只能消毒受精卵表面, 無法徹底切斷病毒的垂直傳播[35]。因此, 對于神經(jīng)壞死病毒的有效防治還需要更多的研究積累。

圖4 赤點石斑魚稚魚的免疫熒光檢測 (箭頭示陽性反應(yīng), A-F 為感染稚魚; G為健康魚)Fig. 4 Immunofluorescent results of the juvenile of red-spotted grouper (positive signal was shown by arrow, A-F were from infected juvenile; G was from non-infected juvenile)

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DISTRIBUTION OF NERVOUS NECROSIS VIRUS IN THE JUVENILE RED-SPOTTED GROUPERS (EPINEPHELUS AKAARA) BY IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOFLUEORESCENT ASSAYS

LIU Xiao-Dan1, HU Xian-Qin1, HUANG Jian-Nan2, WENG Shao-Ping2, WANG Wen-Wen1, CHEN Wen-Jie1, QIN Zhen-Dong1, DONG Xing-Xing1, ZHOU Yang1, LIU Xiao-Ling1, JI Wei1, ZHANG Xue-Zhen3, GUO Zhi-Xun4, HE Jian-Guo2and LIN Li1,3,5
(1. Department of Aquatic Animal Medicine, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275, China; 3. Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Wuhan, 430070, China; 4. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 5. Hubei collaborative Innovation Center for Freshwater Aquaculture, Wuhan, 430070, China)

Nervous necrosis virus (NNV) is a pathogen that infects more than 30 species of economically important fish worldwide. It causes high mortality among juveniles, larvae and even adult fish, and results in significant threat to aquaculture industry. Studying the distribution of NNV in the infected fish may help to understand the pathogenicity. In the present study, we used DIG-in situ hybridization and immunofluorescent assays to evaluate NNV distribution in the infected red-spotted grouper juveniles. The results of DIG-in situ hybridization showed that viral RNA2 was mainly detected in the brain, spinal cord, retina and gill. The immunofluorescent staining results indicated that viral capsid protein was mainly observed in the same tissues. However, both RNA2 and capsid protein were barely detected in the intestine, which indicated that the virus infection may go through the gills instead of the intestine.

NNV; Epinephelus akaara; DIG-in situ hybridization; Immunofluorescent assay; Tissue distribution

S941.4

A

1000-3207(2014)05-0876-07

10.7541/2014.131

2013-08-09;

2014-03-02

國家自然科學(xué)基金面上項目“ 魚類神經(jīng)壞死病毒B2蛋白線粒體定位對病毒的復(fù)制調(diào)控”; 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目“水生經(jīng)濟動物病毒性疾病的綜合防治研究”; 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目“魚類感染與免疫學(xué)研究”聯(lián)合資助

劉曉丹(1989—), 女, 河南鞏義人; 碩士研究生; 主要從事病毒的分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail: l910110526@ 126.com; 胡先勤(1978—), 女, 安徽舒城人; 博士研究生; 主要從事病毒的分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail: huxianqin@163.com. *劉曉丹和胡先勤對此文有同等貢獻

林蠡, E-mail: linli@mail.hzau.edu.cn; 何建國, E-mail: lsshjg@mail.sysu.edu.cn