一種快速構(gòu)建集胞藻6803 petBD必需基因定點(diǎn)突變株的方法

蘆亞菲曲 娜陳曉波匡廷云

(1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050018; 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093)

一種快速構(gòu)建集胞藻6803 petBD必需基因定點(diǎn)突變株的方法

蘆亞菲1曲 娜1陳曉波1匡廷云2

(1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050018; 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所, 光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100093)

集胞藻6803(Synechocystis sp. Strain PCC 6803)是能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)的原核生物, 因其遺傳背景清楚, 特別是它具有天然的同源重組轉(zhuǎn)化能力, 是研究光合作用的模式生物之一[1—3]。以集胞藻進(jìn)行分子生物學(xué)研究, 最常用的方法是基因敲除, 即基于同源重組原理, 利用抗生素的抗性基因插入到目的基因內(nèi)部, 使其功能喪失[4]; 如進(jìn)行定點(diǎn)突變常規(guī)的方法是首先構(gòu)建一個(gè)缺失質(zhì)粒, 通過同源重組缺失目的基因的部分片段; 然后再構(gòu)建一個(gè)回復(fù)突變質(zhì)粒, 在回復(fù)質(zhì)粒內(nèi)部設(shè)計(jì)突變位點(diǎn), 利用同源重組把缺失的基因片段(已經(jīng)包含了突變的位點(diǎn))再次重組進(jìn)基因組, 與此同時(shí)引入第二種抗生素基因, 以第二種抗生素篩選轉(zhuǎn)化子, 經(jīng)連續(xù)篩選, 即可獲得定點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)化子[5—7]。由于這種方法涉及基因的刪除, 所以如果要對(duì)必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 顯然不能采用這種方法。

本研究在參閱相關(guān)研究文獻(xiàn)[6—8]的基礎(chǔ)上, 采用了一種改進(jìn)的方法, 對(duì)集胞藻的必需基因pet BD基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變。Pet BD基因編碼光合膜蛋白細(xì)胞色素 b6f蛋白復(fù)合體的細(xì)胞色素 b6和亞基Ⅳ這兩個(gè)蛋白亞基, 兩個(gè)基因之間有一段約200 bp的非編碼區(qū)。該方法基本原理是在構(gòu)建集胞藻同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒時(shí), 在定點(diǎn)突變位點(diǎn)上游的非編碼區(qū)內(nèi)引入一個(gè)特異酶切位點(diǎn), 經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子后, 以引入的酶切位點(diǎn)作為第二個(gè)篩選標(biāo)記鑒定轉(zhuǎn)化子。在本實(shí)驗(yàn)中為獲得 pet D基因的定點(diǎn)突變株,在其上游pet B和pet D之間的非編碼區(qū)引入了一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)。本研究使用上述方法, 最終鑒定了三個(gè) b6f蛋白復(fù)合體亞基Ⅳ的定點(diǎn)突變株, 單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 以及雙突Gly136Ala/ Thr137Ala。該方法是在集胞藻常規(guī)同源重組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn),克服了常規(guī)的基因敲除法不能構(gòu)建必需基因定點(diǎn)突變株的缺陷, 并且可以快速預(yù)篩選出定點(diǎn)突變株, 為后續(xù)的測(cè)序節(jié)約成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

集胞藻6803藻種為本實(shí)驗(yàn)室保存。集胞藻培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)[1, 9], 突變株培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中加入終濃度為25 μg/mL的卡那霉素。

宿主菌E. coli DH5ɑ用于質(zhì)粒擴(kuò)增的, 本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET 30a, 宿主菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞, pUC18質(zhì)粒購(gòu)自TransGen公司。

1.2 試劑與工具酶

ExTaq DNA Polymerase、dNTP Mixture、Pfu DNAPolymerase 購(gòu)自TaKaRa公司; 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EheⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ購(gòu)自Fermentas公司; DNA ligase、Trans Taq-T DNA Polymerase、Fast Mutagenesis System購(gòu)自TransGen公司; 卡那霉素購(gòu)自Sigma公司。DNA小提中量試劑盒, 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自索萊寶生化科技(北京)有限公司。PCR引物合成以及DNA序列測(cè)序交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司完成。

1.3 同源重組載體的構(gòu)建

參照Putnam-Evans等[6,7]和Yan等[8]的方法構(gòu)建載體,方法如下: 根據(jù)NCBI上提供的集胞藻6803petBD基因序列及其上下游序列和 pET 30a質(zhì)粒中抗卡那霉素基因的表達(dá)框序列, 分別設(shè)計(jì)引物(Up-F、Up-R、Down-F、Down-R和 Kanr-F、Kanr-R; 表 1), 以集胞藻基因組和pET30a質(zhì)粒為模板, 擴(kuò)增出上、下游片段和抗性基因Kanr片段。按上游序列-Kanr片段-下游序列的順序連接到pUC18質(zhì)粒上。

采用 TransGen 公司的快速突變?cè)噭┖?Fast Mutagenesis System), 選擇在petB和petD基因之間的非編碼區(qū)的一段序列AAGATT, 設(shè)計(jì)引物HindⅢ-F和HindⅢ-R(表 1), 進(jìn)行一個(gè)堿基的突變, 引入 HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT), 構(gòu)建成pUC-petBD同源重組質(zhì)粒。

根據(jù)集胞藻6803亞基IV的氨基酸編碼序列設(shè)計(jì)三個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變質(zhì)粒的引物(G-F、G-R; T-F、T-R; D-F、D-R;表1), 采用TransGen公司的快速突變?cè)噭┖? 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 構(gòu)建三個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變質(zhì)粒, 即單突Gly136Ala、單突Thr137Ala 和雙突Gly136Ala/Thr137Ala。

1.4 集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化

集胞藻6803的自然轉(zhuǎn)化按照Williams描述的方法[10]。

1.5 突變株的鑒定

以野生型集胞藻6803和三個(gè)定點(diǎn)突變株的基因組為模板, 分別用 K-F、K-R(表 2)引物鑒定 Kanr片段重組結(jié)果, HindIIIJD-F、HindIIIJD-R(表 2)引物鑒定引入的HindIII酶切位點(diǎn)是否已重組到集胞藻基因組中, 最后用petD-F、petD-R(表2)引物擴(kuò)增petD片段, 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建

同源重組質(zhì)粒 pUC-petBD的構(gòu)建圖譜見圖 1。為了驗(yàn)證構(gòu)建的pUC-petBD載體上petB和petD之間是否引入HindIII酶切位點(diǎn), 設(shè)計(jì)了引物HindIII JD-F和HindIII JD-R(表2), 用該引物對(duì)pUC-petBD載體進(jìn)行擴(kuò)增, 理論產(chǎn)物大小為616 bp, 酶切位點(diǎn)位于第216個(gè)堿基處。圖2是對(duì)引入的酶切位點(diǎn)鑒定的電泳圖, PCR產(chǎn)物大小為600 bp左右, HindⅢ酶切后產(chǎn)生大約200 bp和400 bp的2個(gè)片段, 與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)吻合, 說明成功地在petB和petD之間引入了一個(gè)新的HindⅢ酶切位點(diǎn)。

表1 構(gòu)建同源重組載體定點(diǎn)突變載體所需的引物Tab. 1 Primer sequences for the construction of the site-directed mutagenesis plasmid based on homologous recombination

按照Transgen公司的Fast Mutagenesis System的操作, 以pUC-petBD質(zhì)粒為模板, 根據(jù)集胞藻Cyt b6f亞基IV的編碼序列分別設(shè)計(jì)引物(G-F、G-R; T-F、T-R; 表1),將petD的Gly136(GGC)突變成Ala(GCC)即單突Gly136Ala,Thr137(ACT)突變成Ala(GCT)即單突Thr137Ala。以及以單突Thr137Ala質(zhì)粒為模板, D-F和D-R(表1)為引物構(gòu)建雙突Gly136Ala/Thr137Ala。這三個(gè)定點(diǎn)突變的質(zhì)粒構(gòu)建完成, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確(數(shù)據(jù)未顯示)。

表2 PCR驗(yàn)證突變株所用的引物序列Tab. 2 Primer sequences for the identification by PCR

圖1 同源重組載體pUC-petBD的構(gòu)建圖譜Fig. 1 Schematic describing the construction of the homologous recombinant vector pUC-pet BD

圖2 HindⅢ酶切 pUC-petBD載體PCR產(chǎn)物的電泳分析Fig. 2 An electrophoretogram of HindⅢ-restricted from pUC-petBD vector

2.2 集胞藻6803的轉(zhuǎn)化和Kanr突變株的篩選

將測(cè)序正確的三個(gè)定點(diǎn)突變質(zhì)粒分別與野生型集胞藻6803細(xì)胞混合, 進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 光照下孵育6h后, 涂布于不加卡那覆蓋有硝酸纖維素薄膜的BG-11固體培養(yǎng)基上, 生長(zhǎng)2—3d后, 將濾膜轉(zhuǎn)到含有25 μg/mL 的卡那霉素固體板上培養(yǎng)。同時(shí)以野生型6803作對(duì)照。大約1周后, 野生對(duì)照沒有長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子(圖3a), 而三個(gè)重組平皿分別長(zhǎng)出單菌落(圖3 b, c, d)。

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子, 在25 μg/mL的卡那霉素BG11固體平板上進(jìn)行抗性篩選, 通過 3—5次繼代篩選后, 以野生型集胞藻 6803和三個(gè)定點(diǎn)突變株的基因組為模板, 用K-F和K-R為引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明在野生型集胞藻6803中的PCR產(chǎn)物約為0.3 kb,而在篩選的12個(gè)突變株的PCR產(chǎn)物都為約1.7 kb, 多出了約1.4 kb的抗性基因Kanr(圖4)。這一結(jié)果表明, 在DNA水平上, 抗性基因已經(jīng)重組到了集胞藻中。

2.3 定點(diǎn)突變株株的驗(yàn)證

以野生型集胞藻 6803和 12個(gè)成功重組抗性基因Kanr的突變株基因組為模板, HindⅢJD-F和HindⅢJD-R (表2)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明, 野生和12個(gè)突變株都能擴(kuò)增出616 bp大小的DNA片段, 經(jīng)HindⅢ酶切后, 野生型6803的PCR產(chǎn)物片段不能被切開, 12個(gè)突變株中有5株P(guān)CR產(chǎn)物能夠切出約200 bp和約400 bp兩條帶, 其他 7株未被切開(圖 5)。這一結(jié)果表明, 上述 5株(其 PCR產(chǎn)物能被 HindⅢ酶切開的突變株), 上游同源序列的重組至少開始于petB和petD之間的HindⅢ酶切位點(diǎn), 在一般情況下, 其后的氨基酸突變位點(diǎn)也應(yīng)該重組到集胞藻的基因組中。

圖3 在含25 μg/mL卡那霉素的BG-11固體板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Inducement of the transformants on BG-11 plate containing 25 μg/mL kanamycin (a) Wild type 6803; (b) Single mutant Gly136Ala; (c) Single mutant Thr137Ala; (d) Double mutant Gly136Ala/Thr137Ala

圖4 鑒定突變株是否插入Kanr片段Fig. 4 Identification of the Kanrfragment insertion at DNA level

圖5 鑒定突變株是否插入HindⅢ酶切位點(diǎn)Fig. 5 Identification of the Hind Ⅲ restriction site insertion at DNA level

以上述5株突變株(3、4、7、11、12)和另外7株(1、2、5、6、8、9、10)為模板, 用測(cè)序引物petD-F和petD-R(表2), 擴(kuò)增 petD基因, 對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證, 結(jié)果表明上述5個(gè)突變株確實(shí)發(fā)生了定點(diǎn)突變(測(cè)序結(jié)果未顯示),其中3、4為單突G136A, 7為單突T137A, 11、12為雙突G136A/T137A。而在其他7株當(dāng)中, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證只有1株發(fā)生了定點(diǎn)突變, 另外 6株并未發(fā)生定點(diǎn)突變(測(cè)序結(jié)果未顯示)。

3 討論

集胞藻是光合作用等研究領(lǐng)域常用的一種模式生物, 它具有天然的同源重組特性[1—3]。采用分子生物學(xué)方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行功能研究時(shí), 對(duì)于非必需基因, 無論是進(jìn)行基因敲除還是定點(diǎn)突變, 已經(jīng)有了大量的研究,方法已經(jīng)非常成熟[4—7]。但是對(duì)于編碼細(xì)胞色素 b6f 的亞基Ⅳ蛋白的petD必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 相關(guān)的研究報(bào)道不多。

在同源重組載體上游區(qū)域或下游區(qū)域設(shè)計(jì)突變位點(diǎn),直接轉(zhuǎn)化集胞藻, 因?yàn)橹亟M的起始和終止位點(diǎn)難于確定,無法保證突變位點(diǎn)能夠與基因組發(fā)生重組, 如果盲目地對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序, 無疑會(huì)加大工作量和成本。但是如果在突變位點(diǎn)上游或下游(如果是突變位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒下游區(qū)域的情況)的非編碼區(qū)提前設(shè)計(jì)一個(gè)新的酶切位點(diǎn), 本實(shí)驗(yàn)中在Cyt b6亞基(petB編碼)和亞基Ⅳ(petD編碼)之間的非編碼區(qū)對(duì)一個(gè)堿基進(jìn)行突變, 形成一個(gè)新的HindⅢ的特異酶切位點(diǎn)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子后, 擴(kuò)增該酶切位點(diǎn)上下游區(qū)域, PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切可以鑒定該酶切位點(diǎn)是否重組進(jìn)轉(zhuǎn)化子, 因?yàn)樵?HindⅢ酶切位點(diǎn)在petD基因的上游, 顯然如果這一位點(diǎn)重組進(jìn)了集胞藻基因組, 那么其下游的突變位點(diǎn)也應(yīng)該重組到野生 6803基因組中。因此在突變位點(diǎn)之前非編碼區(qū)引入特異酶切位點(diǎn),可以看作是第二個(gè)篩選標(biāo)記。

在本實(shí)驗(yàn)中, 重組在引入的酶切位點(diǎn)之前發(fā)生的概率是比較高的, 實(shí)驗(yàn)挑選了12個(gè)轉(zhuǎn)化子, 其中 6個(gè)發(fā)生了定點(diǎn)突變, 其中有 5個(gè)鑒定為重組發(fā)生在引入的酶切位點(diǎn)之前, 這可能是與引入的酶切位點(diǎn)與突變位點(diǎn)距離較近和該酶切位點(diǎn)上游的同源序列較長(zhǎng)有關(guān)。上游同源序列總長(zhǎng)約1.7 kb, 引入的HindⅢ酶切位點(diǎn)約在1.0 kb的位置, 定點(diǎn)突變的位點(diǎn)約在1.4 kb的位置, 則酶切位點(diǎn)之前的同源區(qū)為約1.0 kb, 其與定點(diǎn)突變的位點(diǎn)相差約0.4 kb。即使這樣, 在實(shí)驗(yàn)中仍發(fā)現(xiàn)了雖然抗性基因 Kanr已經(jīng)重組到基因組中, 但是 HindⅢ酶切反應(yīng)成陰性, 并且測(cè)序也發(fā)現(xiàn)未發(fā)生定點(diǎn)突變的情況(挑選的12個(gè)轉(zhuǎn)化子中有6個(gè)屬于這種情況)。不難想象, 如果遇到突變位點(diǎn)(或者是引入的酶切位點(diǎn))之前的同源序列較短的情況, 這種方法的優(yōu)勢(shì)可能會(huì)更加顯著。因?yàn)樵谶@種情況下, 同源重組發(fā)生在突變位點(diǎn)下游的概率就會(huì)增加, 即突變位點(diǎn)的序列不發(fā)生同源重組, 那么利用突變位點(diǎn)之前引入的酶切位點(diǎn)為篩選標(biāo)記, 然后對(duì)酶切反應(yīng)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序, 這樣就避免了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的盲目性, 大大提高篩選的效率。

綜上所述, 應(yīng)用本方法對(duì)petD這樣的必需基因進(jìn)行定點(diǎn)突變, 只需構(gòu)建一次質(zhì)粒, 進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化, 剩下的工作主要是應(yīng)用常規(guī)的PCR和酶切對(duì)抗生素平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證, 實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單。該方法不但克服了常規(guī)方法不能用來構(gòu)建必需基因定點(diǎn)突變的缺點(diǎn), 并且可以簡(jiǎn)單快速預(yù)篩選出定點(diǎn)突變株, 對(duì)其他必需基因定點(diǎn)突變的研究具有借鑒意義。

[1] Yan C L, Xu X D. Isolation and characterization of mutants impaired in photoautotrophic growth in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(2): 360—362 [閻春蘭, 徐旭東. 集胞藻 6803光合自養(yǎng)生長(zhǎng)突變株的篩選與鑒定. 水生生物學(xué)報(bào), 2009, 33(2): 360—362]

[2] Fu J, Xu X D. A priA mutant of Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(1): 116—119 [付娟, 徐旭東. 集胞藻PCC6803priA 基因的突變體. 水生生物學(xué)報(bào), 2008, 32(1): 116—119]

[3] Long Z J, Wang Q X, Ma W M, et al. Construction of the ndhO gene inactivation mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 [J]. China Biotechnology, 2010, 30(9): 31—35 [龍宗娟, 王全喜, 馬為民, 等. 利用同源重組構(gòu)建藍(lán)藻集胞藻 6803ndhO基因突變株及其分子鑒定.中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(9): 31—35]

[4] Gao H, Tang Q, Xu X D. Construction of copper-induced gene expression platform in Synechocystis sp. PCC6803 [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31(2): 240—244 [高宏,唐蜻, 徐旭東. 集胞藻 PCC6803銅離子誘導(dǎo)表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(2): 240—244]

[5] Wang M, Shan J X, Kuang T Y, et al. Advances in the research of structure and function of photosystemⅡ core antenna complexes CP43 and CP47 [J]. Chinese Bulletin of Botany, 2000, 17(2): 141—149 [王梅, 單際修, 匡廷云, 等.光系統(tǒng)Ⅱ核心天線復(fù)合物CP43和CP47結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 2000, 17(2): 141—149]

[6] Cindy Putnam-Evans, Jituo Wu, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CP 47 protein of photosystem Ⅱ: alteration of conserved charged residues which lie within lethal deletions of the large extrinsic loop E [J]. Plant Molecular Biology, 1996, 32(6): 1191—1195

[7] Cindy Putnam-Evans, Terry M Bricker. Site-directed mutagenesis of the CPa-1 protein of photosystem II: alteration of the basic residue pair384,385R to384,385G leads to a defect associated with the oxygen-evolving complex [J]. Biochemistry, 1992, 31: 11482—11488

[8] Yan J, Dashdorj N, Cramer W A, et al. On the structural role of the aromatic residue environment of the chlorophyll a in the cytochrome b6f complex [J]. Biochemistry, 2008, 47(12): 3654—3661

[9] Allen M M. Simple conditions for growth of unicellular blue-green algae on plates [J]. Journal of Phycology, 1968, 4(1): 1—4

[10] Williams J G K. Construction of specific mutations in photosystem Ⅱ photosynthetic reaction center by genetic engineering method in Synechocystis 6803 [J]. Methods in Enzymology, 1988, 167: 766—778

A RAPID METHOD FOR SITE-DIRECTED MUTAGENESIS OF THE ESSENTIAL GENE PETBD IN SYNECHOCYSTIS SP. PCC 6803

LU Ya-Fei1, QU Na1, CHEN Xiao-Bo1and KUANG Ting-Yun2
(1. College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Key Laboratory of Photobiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

定點(diǎn)突變; pet BD必需基因; 酶切位點(diǎn); 集胞藻6803

Site-directed mutagenesis; Pet BD essential gene; Restriction site; Synechocystis sp. PCC 6803

Q784; Q-33

A

1000-3207(2014)05-0957-05

10.7541/2014.141

2013-07-01;

2014-02-12

國(guó)家“973”項(xiàng)目(2011CBA00901)資助

蘆亞菲(1988—), 女, 河北石家莊人; 碩士生; 細(xì)胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: 630540631@qq.com

陳曉波(1975—), 男, 河北邯鄲人; 博士; 主要從事細(xì)胞色素b6f復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail: zzschenxiaobo@163.com