不同殼色三角帆蚌外套膜基因的SRAP-cDNA差異分析

聞海波曹哲明金 武顧若波華 丹黃曉飛徐 跑

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國際聯(lián)合實驗室, 無錫, 214081; 3. 南京農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)大學(xué), 無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081)

不同殼色三角帆蚌外套膜基因的SRAP-cDNA差異分析

聞海波1,2,3曹哲明1金 武1顧若波1,2華 丹2黃曉飛3徐 跑1,2,3

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心, 中美淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用國際聯(lián)合實驗室, 無錫, 214081; 3. 南京農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)大學(xué), 無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081)

三角帆蚌幼蚌殼表面顏色和放射條紋表型遺傳分離均符合孟德爾單基因位點的一對等位基因調(diào)控規(guī)律。研究為進(jìn)一步闡釋其殼色遺傳分子調(diào)控機(jī)制, 應(yīng)用群體分離分析法(BAS)和 SRAP-cDNA 比較了兩種典型外殼色表型三角帆蚌外套膜組織的基因表達(dá)差異。采用30個引物組合獲得5個差異片段, 回收克隆測序獲得14條差異序列, 大小在195—339 bp之間, 通過序列比對, 獲得與2個相似蛋白序列, 包括類二氫嘧啶脫氫酶和類鋅指MYM-1型蛋白, 而未發(fā)現(xiàn)與色素合成相關(guān)基因和蛋白, 但三角帆蚌外殼色表型差異是否與嘧啶代謝和類鋅指蛋白參與的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

三角帆蚌; 殼色表型; 外套膜; SRAP-cDNA; 差異基因

貝類的殼色由外套膜表皮分泌形成, 曾被認(rèn)為是一種簡單的表型性狀而被忽視。對許多貝類的研究表明: 殼色不僅與貝類的生態(tài)和行為有關(guān)[1—3],還與其生長、存活等表型性狀密切相關(guān)[4—8]。在國內(nèi)外, 以殼色為選育標(biāo)記, 已經(jīng)成功選育出了高產(chǎn)白色珍珠的日本珍珠貝(Pinctada fucata martensii Dunker)[9]、生長快、抗病力強(qiáng)的“瑪瑙鮑”、金黃殼色的太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[10]、高產(chǎn)的“中科紅”海灣扇貝(Argopecten irradians irradians Lamarck)、“中國紅”皺紋盤鮑(Haliotis discus Hannai)及“南科珍珠紅”馬氏珠母(Pinctada martensii Dunker)等多個貝類新品種(系), 為世界海水貝類養(yǎng)殖發(fā)展與繁榮做出了重大貢獻(xiàn)。殼色與生產(chǎn)性狀協(xié)同選育已經(jīng)成為海水貝類新品種選育最為有效的技術(shù)手段之一。

與海水貝類相比, 淡水貝類殼色較為單調(diào)、表型簡單, 其殼色遺傳研究未受到普遍關(guān)注。三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國最主要的淡水經(jīng)濟(jì)貝類之一。聞海波等[11]首次報道了三角帆蚌F1代幼蚌的殼色表型遺傳分離規(guī)律, 初步研究揭示: 三角帆蚌的殼色和放射條紋分別受單基因位點的一對等位基因調(diào)控。對大多數(shù)海水貝類的殼色遺傳機(jī)制研究也表明: 貝類的殼色受到單個基因位點或少數(shù)基因位點的調(diào)控, 這有利于運用分子生物技術(shù)尋找與殼色相關(guān)的分子標(biāo)記。篩選與殼色相關(guān)基因和分子標(biāo)記, 有助于研究與貝類生長、發(fā)育及成活之間的關(guān)系, 有利于開展貝類殼色與生產(chǎn)性狀的協(xié)同選育。國內(nèi)已采用RAPD[12]、細(xì)胞色素酶[13]、微衛(wèi)星[14]等多種分子生物技術(shù)開展了三角帆蚌遺傳背景分析,為其遺傳改良和品種選育奠定了重要基礎(chǔ), 而與三角帆蚌殼色相關(guān)的基因及分子標(biāo)記的研究尚未開展。SRAP

(Sequence Re1ated Amplified Polymorphism)是Li和Quiros 2001年提出的一種基于PCR的新型分子標(biāo)記, 其反應(yīng)模板多數(shù)是基因組 DNA,也可以是cDNA [15]。SRAP-cDNA技術(shù)已成功運用于蕓薹屬、棉花、甜瓜、野牛草、桃、西葫蘆、筍瓜等經(jīng)濟(jì)作物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及比較基因組學(xué)研究[16]。在水產(chǎn)動物上主要以 DNA為模版, 對草魚[17]、 鲀暗紋東方[18]、馬氏珠母貝“南科珍珠紅”品系[19]及青蝦[20]等品種進(jìn)行 SRAP分子標(biāo)記篩選、分離及遺傳圖譜構(gòu)建。本文采用SRAP-cDNA示差技術(shù), 擬篩選與三角帆蚌殼色表型差異相關(guān)序列, 通過克隆、測序及信息比對, 獲得與殼色形成相關(guān)基因或蛋白序列, 為揭示三角帆蚌殼色遺傳表達(dá)機(jī)制及殼色新品系選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及來源

實驗蚌為2010年建立的三角帆蚌A5家系的F1代幼蚌, 該家系中出現(xiàn) 2種典型的外殼色表型: 青褐殼色具放射條紋和金黃殼色不具放射條紋(圖1)。2011年5月從中隨機(jī)選取2種殼色表型1齡幼蚌各10只, PC8000電子稱測量濕重(0.1 g)、IP6數(shù)顯卡尺測量殼長、殼高、殼寬(0.01 mm)常規(guī)生物學(xué)性狀; 青褐殼色具放射條紋和金黃殼色不具放射條紋幼蚌體重分別為(8.0 ± 2.4) 、(8.8 ± 2.4) g, 殼長為(48.97 ± 4.64)、(51.53 ± 4.03) mm。

圖1 兩種殼色表型的三角帆蚌幼蚌Fig. 1 Two different shell color phenotypes in juvenile Hyriopsis cumingii

1.2 組織總RNA提取

用解剖刀取新鮮外套膜邊緣膜約 50 mg, 采用柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取組織總 RNA, 在瓊脂糖凝膠上檢測 RNA的質(zhì)量和濃度。采用集群分離分析法,取同一殼色表型的10份基因組RNA等量混合, 構(gòu)建兩種不同殼色表型的基因混合池。

1.3 單鏈cDNA的合成

以組織RNA為模版, 選取AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (BIO BASIC INC) 合成單鏈cDNA。

1.4 SRAP -cDNA示差分析

SRAP-PCR反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系, 體系中包括以下成分: DNA 模板3 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 1.5 μL, 10×Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μL, MgCl2 (25 mmol/L) 2.5 μL, 正向引物和反向引物(表 1)各0.5 μL, Taq DNA聚合酶0.2 μL, 無菌重蒸水14.3 μL。PCR反應(yīng)所需試劑及引物均購自上海生工生物工程公司。

在Eppendorf Master cycler PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增程序為: 94℃變性5min; 然后開始5個循環(huán)(94℃變性45s, 38℃退火45s, 72℃延伸l min); 再進(jìn)行30個循環(huán)(94℃變性1min, 55℃退火1min, 72℃延伸l min); 最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物先在2%的瓊脂糖凝膠上電泳, EB染色, 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有無, 然后用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分型, 銀染顯色、拍照、記錄數(shù)據(jù)。將初步篩選到2個的差異序列后, 再用同一引物對所有個體進(jìn)行驗證, 確認(rèn)為差異表達(dá)序列再進(jìn)行回收。

表1 SRAP正反引物序列Tab. 1 Sequences of SRAP F-Primer and R-Primer

1.5 特異擴(kuò)增片段的回收、克隆、測序及比對將特異片

段直接從凝膠上切下, 用100 μL雙蒸水浸泡5min, 棄去洗滌水, 重復(fù)三次, 然后用50 μL雙蒸水浸泡, 用槍頭將膠搗爛, 70℃保溫30min作為模板。特異片斷的擴(kuò)增反應(yīng)總體積為 25 μL, 包括1.5 μL稀釋連接產(chǎn)物, 1.5 μL 10×PCR buffer, 45 pmol HpaⅡ–MspⅠ預(yù)擴(kuò)引物, 1.5 μL dNTPs (2.5 mmol), 2 U Taq 酶, 加水至25 μL。反應(yīng)程序: 94℃變性5min;然后94℃變性20s, 56℃復(fù)性30s, 72℃延伸2min, 反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳,用膠回收試劑盒回收, 克隆進(jìn)pMD18-T載體, 每個差異條帶挑選4個質(zhì)粒, 送上海生物工程公司測序。獲得導(dǎo)入的DNA序列在NCBI上進(jìn)行比對, 尋找相似的DNA序列或蛋白序列。

2 結(jié)果

2.1 SRAP- cDNA示差分析

用30個引物組合擴(kuò)增得到455條擴(kuò)增帶, 初步獲得差異表達(dá)帶5條, 對所有個體進(jìn)行驗證, 確認(rèn)5條帶均為差異條帶。其中4條來自青褐殼具放射條紋群體, 1條來自金黃殼色不具放射條紋群體。圖2為5個引物組合擴(kuò)增結(jié)果圖譜, 其中A 和B為擴(kuò)增差異片段, 均出現(xiàn)在青褐殼色群體中。

圖2 SRAP-cDNA擴(kuò)增圖譜Fig. 2 SRAP-cDNA amplification patterns

2.2 序列比對分析

本研究得到5個差異片段, 克隆測序得到14條不同的序列(表 2), 序列長度在 195—339 bp之間,其中僅3-2-1序列來自金黃殼色群體, 其余13條均來自青褐殼色群體。用NCBI的Blastn程序比對未找到這些序列的相似序列。采用BlastX程序比對發(fā)現(xiàn): 由1-2、2-2引物組合擴(kuò)增獲得的6條差異序列編碼蛋白類均似于二氫嘧啶脫氫酶, 鳉與青(Oryzias latipes)類二氫嘧啶脫氫酶蛋白318—354區(qū)域的相似度為 43%, 該序列位于蛋白 A亞基區(qū)域; 5-1-2序列編碼蛋白與冠輪動物海蠕蟲(Capitella teleta)的一個未知蛋白 40—66區(qū)域相似度為 48%;由5-2引物組合擴(kuò)增獲得的2條序列編碼均類似于鋅指蛋白MYM-1型蛋白, 其中5-2-2序列編碼蛋白與大乳頭水螅(Hydra magnipapillata)類鋅指MYM-1型蛋白的46—90區(qū)域相似度為42%, 且位于未知功能結(jié)構(gòu)域中; 5-2-4序列編碼蛋白與大乳頭水螅的類鋅指MYM1型蛋白77—108區(qū)域相似度為53%, 而與大堡礁海綿(Amphimedon queenslandica)類鋅指MYM-1型蛋白208—246區(qū)域相似度為46%, 均位于該蛋白的未知功能結(jié)構(gòu)域中; 由 3-2引物組合擴(kuò)增的 1條序列編碼也類似二氫嘧啶脫氫酶, 是金黃殼色群體的唯一差異條帶。其中5-1-1差異序列(16個GA重復(fù))和5-2-3差異序列(23個CA重復(fù))中各出現(xiàn)有一個微衛(wèi)星序列。

表2 差異序列的BlastX比對Tab. 2 Different sequences alignment by BlastX

3 討論

與AFLP-cDNA技術(shù)相比, SRAP-cDNA具有兩大優(yōu)點: 第一、技術(shù)流程簡單, 不需要第二鏈的合成,且能夠檢測到某些低水平表達(dá)的基因, 實驗成本低;第二、多數(shù)產(chǎn)生高強(qiáng)帶, 重疊少, 得到的差異序與蛋白質(zhì)相關(guān)性更高。Dinler等[21]利用SRAP技術(shù)研究翦股穎(禾本科)不同個體的序列表達(dá)標(biāo)簽, 通過比較這些序列發(fā)現(xiàn)很多個體特異的序列都是同源的, 可以用于蛋白質(zhì)組的比較。Gui等[22]利用SRAP研究Brassica allotetraploids異源多倍體化發(fā)現(xiàn), 異源多倍體化的可以激活大約1.3%的在二倍體中不表達(dá)的轉(zhuǎn)錄單元。盧泳全等[23]應(yīng)用SRAP技術(shù)對大米草的耐鹽性狀進(jìn)行差異顯示研究, 鑒定出一個與水稻葡聚糖酶基因有30%相似性的差異片段。馬愛芬等[24]選用培育7年的重組自交系群體(RILs), 利用SRAP-cDNA技術(shù)進(jìn)行了差異顯示研究, 996對SRAP引物組合擴(kuò)增出2100條帶, 2次擴(kuò)增重復(fù)率為65.2%,其中在黃黑籽材料之間重復(fù)穩(wěn)定出現(xiàn)的差異片段有12條, 發(fā)現(xiàn)2個片段分別與擬南芥的NAD+ADP核糖轉(zhuǎn)移酶及小肽轉(zhuǎn)移蛋白3具有很高的同源性。

本文嘗試將SRAP-cDNA技術(shù)應(yīng)用在三角帆蚌外殼色基因差異表達(dá)分析, 采用30個引物組合共擴(kuò)增出455個條帶, 僅有5個差異序列, 差異序列占總數(shù)1.1%, 說明外殼色差異涉及的基因較少, 也進(jìn)一步證實三角帆蚌外殼色性狀可能受到少數(shù)基因位點調(diào)控, 與外殼色表型在F1代幼蚌中分離符合孟德爾單基因調(diào)控的規(guī)律的結(jié)論相符[11]。通過進(jìn)一步克隆測序獲得14條差異序列, 由于三角帆蚌的目前序列知之甚少, 未比對到相似基因序列, 但找到了與2個相關(guān)蛋白序列: 類二氫嘧啶脫氫酶和類鋅指MYM-1型蛋白, 進(jìn)一步證實了SRAP-cDNA技術(shù)具有容易尋找到相關(guān)序列蛋白的特點。

二氫嘧啶脫氫酶(Dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD)是嘧啶分解途徑的限速酶, 它催化尿嘧啶和胸腺嘧啶分別還原為二氫尿嘧啶和二氫胸腺嘧啶, 體內(nèi)80%的5-氟尿嘧啶由DPD降解[25], 其編碼基因(DPYD)的突變是二氫嘧啶脫氫酶活性降低和引起氟化嘧啶類化療藥物毒性的重要原因之一。在青褐色群體中出現(xiàn)了6條差異條帶的編碼蛋白均類似二氫尿嘧啶脫氫酶, 推測三角帆蚌殼色形成可能與嘧啶代謝途徑中的某些蛋白相關(guān)。鋅指結(jié)構(gòu)于1983年首先發(fā)現(xiàn)于爪蟾5S RNA基因的轉(zhuǎn)錄因子IIIA (TFIIIA), 其三維結(jié)構(gòu)由一個含有大約30個氨基酸的環(huán)和一個與環(huán)上的4個Cys或2個Cys和2個His配位的Zn2+構(gòu)成, 形成的結(jié)構(gòu)類似手指狀, 該蛋白廣泛存在于生物體基因組中, 占據(jù)大于人類基因組1%的基因, 能與特定DNA序列、RNA及蛋白結(jié)合, 與細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及人類多種疾病相關(guān)[26]。本研究獲得兩種不同外殼色三角帆蚌的外套膜的2種相似蛋白, 而未發(fā)現(xiàn)與相關(guān)色素合成的基因和蛋白, 但三角帆蚌外殼色表型是否與這兩種基因或蛋白的表達(dá)差異有直接關(guān)系, 仍有待進(jìn)一步的研究。

在海洋貝類中已找到一些與殼色相關(guān)的分子標(biāo)記。Qin, et al.[27]對海灣扇貝的研究中, 將殼色基因分別作為母本標(biāo)記和父本標(biāo)記, 并同時進(jìn)行雌性及雄性連鎖圖譜的構(gòu)建, 殼色標(biāo)記定位在了雌性圖譜第九連鎖群上; 利用 AFLP技術(shù)在海灣扇貝中找到了 6個與殼色相關(guān)的分子標(biāo)記, 其中兩個標(biāo)記Flf335和D8f420與殼色基因之間遺傳圖距為0 cM,經(jīng)過在家系和群體中初步驗證, 證明這兩個標(biāo)記與橘黃殼色位點緊密或完全連鎖。相比之下, 在擴(kuò)增出的 10個微衛(wèi)星中卻未找到與殼色相關(guān)的分子標(biāo)記。孫秀俊等[28]用 RAPD 技術(shù)對比了蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)白色貝和褐色貝群體的遺傳差異, 發(fā)現(xiàn)位點 S285-1在褐色貝 75% 的個體中都能獲得擴(kuò)增片段, 但在白色貝所有個體中都沒有這個位點的擴(kuò)增片段, 由此推斷該位點的缺失與殼色存在一定的關(guān)系。朱東麗等[29]利用AFLP篩選到一個細(xì)紋文蛤品系的特有分子標(biāo)記, 出現(xiàn)頻率為1.00; 利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù), 對4個殼色花紋品系的文蛤(Meretrix meretrix)進(jìn)行了遺傳分析, 從中篩查出與殼色花紋相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記[30]。進(jìn)一步以本文的差異序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異 TRAP引物, 篩選出穩(wěn)定殼色 SCRA標(biāo)記, 從而更加全面揭示三角帆蚌外殼色形成的分子遺傳機(jī)制, 為殼色定向選育提供有力的工具。

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ANALYSIS OF DIFFERENTIAL GENE EXPRESSION BY SRAP-cDNA IN MANTLE TISSUE OF HYRIOPSIS CUMINGII WITH DIFFERENT EXTERNAL SHELL COLOR

WEN Hai-Bo1,2,3, CAO Zhe-Ming1, JIN Wu1, GU Ruo-Bo1,2, HUA Dan2, HUANG Xiao-Fei3and XU Pao1,2,3
(1. Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China; 2. Sino-US Cooperative Laboratory for Germplasm Conservation and Utilization of Freshwater Mollusks, Freshwater Fisheries Research Center, Wuxi, Jiangsu 214081, China; 3. Wuxi Fishery college, Nanjing Agriculture University, Wuxi 214081, China)

The segregation of shell coloration and presence of radial rays in the juvenile freshwater mussel, Hyriopsis cumingii, follows Mendelian inheritance modes of a single gene locus with one pair of dominant/recessive alleles. To elucidate the mechanisms of external shell color formation, gene expression of two typical shell colors was analyzed by bulked segregant analysis (BSA) and SRAP-cDNA. Five differential gene segments were obtained by SRAP-cDNA using 30 primers’ combinations, and 14 fragments with the size ranging from 195 bp to 339 bp were obtained after reclaim and clone. Using BlastX, these fragments could encode two similar proteins, dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) and MYM-1 Zn Finger protein, and no protein related to pigment could be encoded. Further directions should focus on the relationship between shell color phenotype and pyrimidine metabolism by similar Zn finger proteins in the triangle pearl mussels.

Hyriopsis cumingii; Shell color phenotype; Mantle tissue; SRAP-cDNA; Differential genes

Q344+.1

A

1000-3207(2014)05-0848-06

10.7541/2014.127

2013-07-10;

2014-02-11

國家公益性行業(yè)科研專項(200903028); 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(20l1JBFA18)資助

聞海波(1980—), 男, 江蘇靖江人; 博士, 助理研究員; 主要從事淡水貝類種質(zhì)資源保護(hù)及利用研究。E-mail: wenhb@ffrc.cn

顧若波(1963—), 男, 江蘇無錫人; 碩士, 研究員; 主要從事水產(chǎn)動物遺傳及養(yǎng)殖研究。E-mail: gurb@ffrc.cn