生長激素/催乳素家族配體和受體成員在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)比較和交叉活性分析

于力群王厚鵬朱作言孫永華

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

生長激素/催乳素家族配體和受體成員在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)比較和交叉活性分析

于力群1,2王厚鵬1朱作言1孫永華1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

為了進(jìn)一步研究 GH/PRL家族信號(hào)通路在魚類早期胚胎發(fā)育中的作用, 研究以斑馬魚為模型, 通過Real-time PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)刻畫并比較了GH/PRL家族成員及其受體家族成員在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在配體家族成員中, 生長激素(Growth hormone, GH)和生長催乳素(Somatolactin, smtl)存在母源表達(dá), 在受體家族成員中, ghra、ghrb存在母源表達(dá)。利用熒光素酶分析spi2.1啟動(dòng)子活性的結(jié)果初步證明, 在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中, 各配體家族成員與GHRa之間可以發(fā)生廣泛的互作。這一系列結(jié)果對(duì)于我們認(rèn)識(shí)GH/PRL家族信號(hào)通路在斑馬魚早期發(fā)育中的作用具有重要的指導(dǎo)意義。

生長激素; 生長激素受體; GH/PRL家族信號(hào)通路; 斑馬魚; 早期表達(dá)

生長激素(Growth hormone, GH)及催乳素(Prolactin, PRL)是同源蛋白質(zhì), 由190—209個(gè)氨基酸構(gòu)成, 被認(rèn)為是來源于同一個(gè)祖先基因的兩段連續(xù)的串聯(lián)重復(fù)序列[1]。之后的研究發(fā)現(xiàn)魚類生長催乳素(Somatolactin, SMTL)與GH/PRL家族成員具有較高的相似性[2], 但是SMTL、GH和PRL是否來源于同一祖先基因依然是一個(gè)懸而未決的問題。不論在硬骨魚還是其他脊椎動(dòng)物中, GH/PRL家族成員都是由垂體分泌的。作為一類肽類激素, GH及其家族成員結(jié)合相應(yīng)的膜受體后激活酪氨酸激酶詹納斯激酶2(JAK2), 開啟多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而起始一系列生物反應(yīng)。這些反應(yīng)包括細(xì)胞的增殖、分化、遷移、抗凋亡、細(xì)胞骨架的重組以及調(diào)控代謝通路等[3]。

生長激素受體(Growth hormone receptor, GHR)及催乳素受體(Prolactin receptor, PRLR)屬于細(xì)胞激酶受體超家族。與配體家族相似, GH/PRL蛋白家族的受體同樣被認(rèn)為由同一祖先進(jìn)化而來。所有這些受體都是單鏈的跨膜蛋白, 由膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)三部分組成, 屬于細(xì)胞激酶I型受體。它們本身不具有激酶活性, 對(duì)于下游信號(hào)傳導(dǎo)過程的激活需要受體相關(guān)激酶如詹納斯激酶(JAK)及Src激酶的參與[4, 5]。

不同于GH的受體GHR和PRL的受體PRLR,對(duì)于SMTL受體的鑒定工作一直存在爭議。最早關(guān)于 SMTL受體的報(bào)道來自于鮭魚(Salmo salar), 報(bào)道將SMTL受體劃歸為GHRa的進(jìn)化分支[6]。后續(xù)在青 鳉(Oryzias latipes)及其他魚類中的研究讓人們更加相信GHRa是真正的SMTL的受體, 而GHRb才是GH的受體[7,8]。然而, 也有不少研究對(duì)這一觀點(diǎn)持否定看法, 研究者在鯛魚(Acanthopagrus schlegeli)、鰻魚(Anguilla japonica)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)以及最近在斑馬魚(Danio rerio)中的研究都認(rèn)為相比于SMTL, GH和GHR成員之間存在較高的親和性[9—12]。這些結(jié)果都提示GH/PRL蛋白家族與它們相應(yīng)的受體可能并非嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,它們之間很可能存在交叉作用。

在之前的研究中, 我們?cè)诎唏R魚的卵巢中檢測(cè)到gh及其受體ghra基因的轉(zhuǎn)錄, 并且在2細(xì)胞期的胚胎中檢測(cè)到這2種基因的母源表達(dá)[13]。我們的合作者也發(fā)現(xiàn)在小鼠早期發(fā)育的時(shí)期中, GH的表達(dá)貫穿始終[14]。這些結(jié)果暗示, GH/PRL家族成員在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中可能存在重要作用。但是, 目前對(duì)于 GH/PRL家族成員及其受體編碼基因在胚胎發(fā)育早期進(jìn)行詳細(xì)表達(dá)分析的報(bào)道極少。對(duì)GH/PRL家族及其受體基因家族成員在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)模式進(jìn)行刻畫, 對(duì)于我們進(jìn)一步研究GH/PRL家族信號(hào)通路在斑馬魚早期發(fā)育中的作用有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚及胚胎收集

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚(Danio rerio)來自于國家斑馬魚資源中心(中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢),按照斑馬魚手冊(cè)方法培養(yǎng)[15]。胚胎通過自然受精方法獲得, 受精后的胚胎用200 μL的10 mg/mL 蛋白酶(Sigma-Aldrich, USA)脫去絨毛膜。脫膜后的胚胎置于底部有瓊脂的塑料培養(yǎng)皿中, 使用 0.3X Danieau’s Buffer [58 mmol/L NaCl、0.7 mmol/L KCl、0.4 mmol/L MgSO4、0.6 mmol/L Ca(NO3)2、5 mmol/L Hepes, pH 7.6]在28.5℃培養(yǎng)。用于Real-time PCR分析的胚胎達(dá)到特定時(shí)期(2 細(xì)胞期、high oblong、75% 外包、體節(jié)早期、受精后 1d、受精后 2d、受精后 3d、成魚的腦及肝臟)后, 將胚胎放于TRIzol?試劑, 保存于–70℃冰箱。用于原位雜交的胚胎達(dá)到特定時(shí)期(1 細(xì)胞期、75%外包、體節(jié)早期、體節(jié)中期、受精后1d、受精后2d)后, 用4%的多聚甲醛 4℃固定過夜。胚胎發(fā)育階段的界定參見Kimmel等的描述[16]。

1.2 全長cDNA的克隆及基因亞克隆、質(zhì)粒構(gòu)建及體外轉(zhuǎn)錄

根據(jù) GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)提供的序列信息, 設(shè)計(jì)用于克隆gh (NM_001020492.2)、prl (NM_181437.3)、prl2 (FJ475111.1)、smtla (NM_ 001037706.1)、smtlb (NM_001037674.1)、ghra (NM_ 001083578.1)、ghrb (NM_001111081.1)、prlra (NM_ 001128677.1)、prlrb (NM_001113500.1)基因全長cDNA的引物(表1)。以斑馬魚腦及肝臟cDNA為模板, 使用 dNTPs, LA Taq?(TAKARA, Japan), LA Taq?Buffer, MgSO4以及相應(yīng)的引物擴(kuò)增gh、prl、prl2、smtla、smtlb、ghra、ghrb、prlra、prlrb基因的CDS。然后使用單酶切或雙酶切將擴(kuò)增出的CDS序列亞克隆到 pCS2+質(zhì)粒載體中, 挑克隆測(cè)序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒使用Not I 單酶切得到線性化質(zhì)粒, 然后使用SP6 RNA聚合酶mMessage mMachine試劑盒(Ambion, USA)合成相應(yīng)的 mRNA。全長 cDNA克隆所用引物見表1。

表1 全長cDNA克隆所用引物信息Tab. 1 Primers used for cDNA clone

1.3 斑馬魚 GH/PRL蛋白家族及其受體成員序列分析

通過我們克隆得到的全長 cDNA序列, 使用Vector NTI (美國Invitrogen公司)軟件翻譯得到GH、PRL、PRL2、SMTLα、SMTLβ、GHRa、GHRb、PRLRa、PRLRb的氨基酸序列信息。通過Vector NTI軟件的Align X模塊分別對(duì)配體家族成員及受體成員進(jìn)行多序列比對(duì), 并根據(jù)文獻(xiàn)所述對(duì)配體及受體的重要功能域進(jìn)行同源比對(duì)[17]。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)

根據(jù)前述克隆得到的全長 cDNA序列以及GenBank中獲得的β-actin (NW_001878804.3) 序列信息, 設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物(表2)。將TRIzol中保存的胚胎充分勻漿, 用酚-氯仿法提取 RNA并將抽提產(chǎn)物用DNase I處理。使用ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO, Japan), 將 2 μg總 RNA產(chǎn)物以O(shè)ligo (dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成好cDNA與引物, 反應(yīng)緩沖液以及iTaq Universal SYBR Green Supermix (BIO-RAD, USA)混合好放入 CFX96 實(shí)時(shí)定量PCR儀(BIO-RAD, USA)中反應(yīng)。所有反應(yīng)均按以下條件設(shè)置: 95℃預(yù)變性1min后, 以95℃ 15s、 60℃ 15s、72℃ 45s反應(yīng)40個(gè)循環(huán), 之后接一步默認(rèn)的溶解曲線分析程序。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(Ct值)通過 CFX manager軟件(BIO-RAD, USA)獲得, 以β-actin作為內(nèi)參照物使用 2–ΔΔCt方法[18]處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多組數(shù)據(jù)平均值之間的顯著性差異使用SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA)通過單因素方差分析及Duncan’s multiple range檢驗(yàn)分析確定。實(shí)驗(yàn)中所用引物見表2。

1.5 全胚胎原位雜交

將前述的重組質(zhì)粒用Hind III (NEB, USA)單酶切, 形成線性化質(zhì)粒。以此線性化質(zhì)粒為模板, 使用T7 RNA聚合酶(Promega, USA)和地高辛RNA標(biāo)記混合物(Roche, USA)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成得到反義RNA探針。將 4%多聚甲醛固定的胚胎參照 Thisse等的方法進(jìn)行全胚胎原位雜交[19]。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR所用引物信息Tab. 2 Primers used for Real-time PCR

1.6 體內(nèi)熒光素酶分析

向斑馬魚1細(xì)胞期胚胎注射pTKRenilla熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Promega, 0.5 pg)與 pGL3 spi2.1質(zhì)粒(50 pg)混合注射液來評(píng)估GH/PRL家族信號(hào)通路活性水平。pTKRenilla熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒作為內(nèi)參。之后向這些胚胎中分別注射 gh mRNA (300 pg)、ghra (400 pg)、gh+ghra (300 pg+400 pg)、prl+ghra(300 pg+400 pg)、prl2+ghra(300 pg+400 pg)、smtlα+ ghra (300 pg+400 pg)、smtlβ+ghra(300 pg+400 pg) mRNA注射液。待注射的胚胎發(fā)育至1dpf時(shí), 使用Passive Lysis Buffer裂解胚胎。熒光素酶活性通過Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA)獲得。熒光素酶相對(duì)活性的計(jì)算按本實(shí)驗(yàn)室已鑒定方法[20]。多組數(shù)據(jù)平均值之間的顯著性差異使用SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA)通過單因素方差分析及Duncan’s multiple range檢驗(yàn)分析確定。P值＜ 0.05認(rèn)為存在顯著性。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚 GH/PRL蛋白家族成員及其受體的氨基酸序列分析

斑馬魚 GH/PRL基因家族主要包括 5個(gè)成員,分別是growth hormone (gh)、 prolactin (prl)、prolactin 2 (prl2)、somatolactin alpha (smtla)以及somatolactin beta (smtlb)。相應(yīng)的, 在受體基因家族中有4個(gè)成員,分別是 growth hormone receptor a (ghra)、growth hormone receptor b (ghrb)、prolactin receptor a (prlra)以及prolactin receptor b (prlrb)。它們的核苷酸序列相似性較高, 配體基因之間的相似性在 40%左右,而受體基因的相似性則高達(dá) 63%, 這暗示配體和受體家族成員分別來源于同一祖先基因。對(duì)于這樣 2類蛋白家族, 我們更多地是關(guān)注其氨基酸序列之間的相似性。

在斑馬魚 GH/PRL配體家族中, 雖然蛋白成員之間的氨基酸序列相似性僅為 30.9%, 但是幾個(gè)重要功能域的序列存在較高的保守性。根據(jù)人GH相關(guān)研究推定的兩個(gè)受體結(jié)合域中, 結(jié)合域 1中占據(jù)85%結(jié)合能力的8個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)中的P61、K172位點(diǎn)在斑馬魚 GH/PRL配體家族成員中完全保守, R61、T175、F176和R176等4個(gè)位點(diǎn)在配體家族成員中高度保守; 結(jié)合域2中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)G120在所有GH/PRL配體家族成員中完全保守[17]。這一結(jié)果揭示, GH/PRL蛋白家族的各成員可能都具有與GHR結(jié)合的能力。

斑馬魚GH/PRL受體家族成員的氨基酸序列更加保守, 序列相似程度達(dá)49.8%。與配體家族成員類似, 保守的氨基酸位點(diǎn)主要集中在關(guān)鍵的功能域。其中負(fù)責(zé)與配體結(jié)合的胞外段序列相似性為64.9%,值得注意的是與 GH結(jié)合的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)W104、W169在受體家族成員中完全保守。此外, 受體成員的跨膜段以及膜內(nèi)段的box1、box2也保持高度同源性, 其中box1結(jié)構(gòu)域有高達(dá)75%的氨基酸位點(diǎn)完全保守(圖1); 而主要的序列差異則發(fā)生在胞內(nèi)段的box2下游, 這暗示不同的受體成員對(duì)下游信號(hào)有著不同的激活作用。

2.2 GH/PRL家族成員及其受體基因在斑馬魚早

期胚胎中的相對(duì)表達(dá)分析

為了研究GH/PRL家族配體和受體成員在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的表達(dá)模式, 我們首先利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)所有這些基因在斑馬魚早期發(fā)育重要時(shí)期的表達(dá)情況。在配體基因家族中, 可以檢測(cè)到gh以及smtla在2細(xì)胞期存在轉(zhuǎn)錄(圖2A、2C)。在此之后, 配體家族成員的基因表達(dá)全部消失。這一表達(dá)沉默一直持續(xù)到受精后 1d (1day postfertilization, 1dpf), 從1dpf開始, 可以檢測(cè)到合子型的prl和smtla表達(dá)(圖 2B、2C); 到2dpf, gh以及smtlb也開始了合子表達(dá)(圖 2A、2D); prl2在 3dpf仍然沒有表達(dá)。

在受體基因家族中, ghra以及ghrb的早期表達(dá)可以在 2細(xì)胞期檢測(cè)到, 在此之后, 它們的表達(dá)量減少(圖 3A、3B)。到75%外包時(shí)期, 所有的受體家族成員基因都出現(xiàn)了一次急劇的表達(dá)增加(圖 3A—3D)。這一輪的表達(dá)持續(xù)到 1dpf的胚胎, 此時(shí)新的一輪表達(dá)開始出現(xiàn), 4個(gè)基因的表達(dá)量又一次提升到更高的水平。形成與配體基因表達(dá)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄峰值。

2.3 GH/PRL家族成員及其受體基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn), 我們?cè)谂潴w家族和受體家族中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)在2細(xì)胞期存在表達(dá)的基因, 分別是配體家族的gh、smtla和受體家族的ghra、ghrb。針對(duì)這4種可能存在母源表達(dá)的基因, 我們利用全胚胎原位雜交技術(shù)對(duì)它們?cè)诎唏R魚卵巢組織和胚胎形成期的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行詳細(xì)分析。

與熒光定量PCR的結(jié)果相一致, 對(duì)卵巢組織的原位雜交分析表明gh以及smtla的轉(zhuǎn)錄本可以在卵巢組織中不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞中被檢測(cè)到(圖4A、4C)。受精之后, 在1細(xì)胞期的胚胎中, 這些基因的表達(dá)產(chǎn)物廣泛分布在整個(gè)細(xì)胞中(圖 4E、4J)。而利用正義RNA探針作為對(duì)照的組織及胚胎中, 則沒有檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)(圖 4B、4D、4F、4K)。在此之后, 直到1 dpf, 配體基因的合子型表達(dá)才開始激活。此時(shí), 在頭部前端口凹形成處附近出現(xiàn)了有分泌功能的垂體細(xì)胞系[21], 這簇細(xì)胞開始表達(dá)合子型的smtla基因(圖 4M、4N)。從受精后26h左右開始,功能性的垂體前體開始內(nèi)化, 向頭部內(nèi)側(cè)遷移, 到2 dpf的時(shí)候, gh的表達(dá)也開始在這一簇細(xì)胞出現(xiàn)(圖 4H、4I)。

圖1 斑馬魚GH/PRL受體家族成員序列的多重比對(duì)分析Fig. 1 Multiple alignment of members’ sequences in zebrafish GH/PRL receptor family

圖2 GH/PRL家族成員在斑馬魚早期胚胎中的相對(duì)表達(dá)分析Fig. 2 Relative expression analysis of GH/PRL family members in Zebrafish embryos

圖3 GH/PRL受體家族成員在斑馬魚早期胚胎中的相對(duì)表達(dá)分析Fig. 3 Relative expression analysis of GH/PRL receptor family members in Zebrafish embryos

圖4 GH/PRL家族成員在斑馬魚卵巢組織和早期胚胎中的時(shí)空表達(dá)Fig. 4 Spatio-temporal expression of GH/PRL family members in Zebrafish ovary and embryos

在受體家族中, ghra以及ghrb的表達(dá)圖式非常相似。在卵巢組織內(nèi)就可以檢測(cè)到基因在卵母細(xì)胞中的表達(dá)(圖 5A、5C)。在1細(xì)胞期, 基因的表達(dá)分布在整個(gè)細(xì)胞中(圖 5E、5J), 之后表達(dá)信號(hào)逐漸減弱。而利用正義RNA探針作為對(duì)照的組織及胚胎中,則檢測(cè)不到表達(dá)信號(hào)(圖 5B、5D、5F、5K)。從體節(jié)期開始, ghra定位表達(dá)在胚胎中線附近的內(nèi)層細(xì)胞(圖 5G), ghrb表達(dá)在胚胎的后部(圖 5L)。到受精后20h, ghra以及ghrb的信號(hào)開始在體節(jié)區(qū)域表達(dá)(圖 5H, 5M), 這一定位表達(dá)持續(xù)到 1 dpf左右(圖5I、5N), 這些結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致。

圖5 GH/PRL受體家族成員在斑馬魚卵巢組織和早期胚胎中的時(shí)空表達(dá)Fig. 5 Spatio-temporal expression of GH/PRL receptor family members in zebrafish ovary and embryos

2.4 GH/PRL配體家族成員與 GHRa互作的初步分析

通過熒光定量PCR及原位雜交實(shí)驗(yàn), 我們已經(jīng)證明gh/prl家族成員及其受體基因存在母源和早期胚胎表達(dá)的現(xiàn)象。另外通過原位雜交的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn), 在 1細(xì)胞期, 無論是配體家族的 gh、smtla, 還是受體家族中g(shù)hra、ghrb的表達(dá)均廣泛分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。此外, 考慮配體和受體家族成員的重要功能域在氨基酸序列上的高度保守性(圖2), 我們推測(cè)在斑馬魚早期胚胎中, GH/PRL家族成員與配體家族成員之間存在交叉互作。

為了初步驗(yàn)證我們的推測(cè), 我們利用此前建立的評(píng)估GH/PRL家族信號(hào)通路活性的spi2.1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來評(píng)估GHRa與配體家族成員之間的相互作用[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6), 單獨(dú)注射gh mRNA并不能顯著增強(qiáng)spi2.1啟動(dòng)子的活性。單獨(dú)注射ghra mRNA可以顯著增強(qiáng)spi2.1啟動(dòng)子活性至約1.79倍。通過共注射ghra以及gh/prl家族成員的mRNA, spi2.1的啟動(dòng)子活性相較于野生型增加至1.86—5.10倍, 且配體mRNA與ghra mRNA共注射后激活spi2.1啟動(dòng)子的活性均顯著高于ghra mRNA單獨(dú)注射的效應(yīng), 這表明過表達(dá)的配體與GHRa均存在互作。同時(shí),結(jié)果顯示各配體與GHRa互作后激活下游信號(hào)通路能力的總趨勢(shì)為PRL＞SMTL＞GH。通過以上結(jié)果,我們初步證實(shí)了GH/PRL家族各配體成員與受體成員GHRa之間在胚胎發(fā)育早期存在相互作用, 這為我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了模型, 也為我們今后對(duì)GH/PRL家族信號(hào)通路的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 GH/PRL配體家族成員與GHRa互作的spi2.1啟動(dòng)子活性分析Fig. 6 Spi2.1 promoter assay of GH/PRL family member coinjection with GHRa

3 討論

生長激素屬于GH/PRL蛋白質(zhì)超家族, 是由垂體分泌的, 調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移, 促進(jìn)生物體生長的一種重要多肽類激素[1]。目前關(guān)于GH/PRL超家族信號(hào)通路對(duì)動(dòng)物出生后生長的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟。但是, 最近的一些研究發(fā)現(xiàn)GH/PRL家族成員在生物體發(fā)育的早期存在表達(dá)[20], 這些結(jié)果暗示GH/PRL家族在生物體早期發(fā)育過程中可能存在重要功能。目前對(duì)于生長激素配體家族及受體家族成員在早期發(fā)育過程中的表達(dá)缺乏系統(tǒng)分析, 這嚴(yán)重阻礙了我們對(duì)于其功能的研究。

在本實(shí)驗(yàn)中, 我們以斑馬魚為研究對(duì)象, 首先通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 無論在配體家族還是受體家族中, 成員間的氨基酸相似程度較高, 而主要的保守區(qū)域集中在重要的功能域位置。在配體成員中, 與受體結(jié)合的兩個(gè)重要功能域的重要氨基酸位點(diǎn)均高度保守。而在受體家族中, 與配體結(jié)合的膜外段也有較高的序列相似性。這些結(jié)果提示在GH/PRL配體家族與受體成員間可能存在相互作用。

雖然之前有研究者對(duì)GH/PRL家族成員的早期表達(dá)進(jìn)行了刻畫, 但是他們基本都針對(duì)家族中個(gè)別基因進(jìn)行研究[20,22], 相關(guān)研究并不系統(tǒng)。為了進(jìn)一步研究該家族配體和受體成員在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)情況, 我們通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)生長激素家族所有配體和受體成員的表達(dá)進(jìn)行了細(xì)致分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), gh和smtla存在母源表達(dá)。在2細(xì)胞期之后, mRNA的表達(dá)豐度大大降低, 從卵裂期到囊胚期維持在最低水平。到受精后1天, prl和smtla的合子型表達(dá)開始出現(xiàn), 受精后2天, gh和smtlb的表達(dá)再次出現(xiàn)。在受體家族中, ghra和ghrb的mRNA表達(dá)可以在2細(xì)胞期被檢測(cè)到, 其表達(dá)豐度在卵裂期大大降低。到原腸胚期所有受體家族成員的基因表達(dá)量明顯升高, 表明合子型受體家族成員表達(dá)的開始顯著早于功能性垂體的發(fā)育。

更進(jìn)一步, 我們利用原位雜交技術(shù)詳細(xì)刻畫了該家族具有母源或早期表達(dá)的配體和受體成員在魚類早期發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)模式。通過對(duì)斑馬魚卵巢組織和發(fā)育的不同階段的胚胎進(jìn)行表達(dá)分析。我們發(fā)現(xiàn), 具有母源表達(dá)的gh、smtla以及受體家族的ghra、ghrb的mRNA在發(fā)育的卵母細(xì)胞和受精后1細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中廣泛存在。在囊胚期開始后,這些基因的mRNA表達(dá)消失。到75%外包時(shí)期, ghra開始定位表達(dá)在胚胎中線附近的內(nèi)層細(xì)胞而ghrb表達(dá)在胚胎的后部。到受精后20h, ghra以及ghrb的信號(hào)開始在體節(jié)區(qū)域并持續(xù)到1dpf。與此同時(shí), smtla的合子表達(dá)特異性的出現(xiàn)在頭部前端口凹形成處,到2dpf, gh的合子型mRNA也可以在頭部檢測(cè)到特異的表達(dá)信號(hào)。

GH/PRL家族成員與其受體之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系一直存在較大爭議[12]。實(shí)際上, 由于GH/PRL家族成員及其受體成員之間的結(jié)構(gòu)保守性較高, 很難在它們之間劃定嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng), 我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚早期胚胎中共注射gh/prl家族成員與ghra mRNA后, 熒光素酶相對(duì)活性比野生型胚胎提高1.8—5.1倍。這說明在斑馬魚早期胚胎中GH/PRL配體家族成員均能與GHRa互作并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄, 而這其中prl與ghra共注射之后的增強(qiáng)效果最為明顯, 這可能與不同配體在早期胚胎發(fā)育中的內(nèi)源表達(dá)水平相關(guān)。由于prl不存在母源的本底表達(dá), 因此注射外源prl mRNA可能對(duì)下游信號(hào)有更強(qiáng)的激活作用。

綜上所述, 我們的研究發(fā)現(xiàn)生長激素信號(hào)配體家族及受體家族中均存在母源表達(dá)的成員, 這暗示了GH/PRL家族信號(hào)通路在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的重要功能。而針對(duì)該信號(hào)通路靶基因 spi2.1的啟動(dòng)子活性分析結(jié)果也初步證明, 在斑馬魚早期胚胎中配體家族成員與受體之間存在交叉作用。這提示我們GH/PRL家族信號(hào)通路在斑馬魚早期發(fā)育中的作用是通過家族成員之間的協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)的。

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THE COMPARATIVE EXPRESSION AND CROSS-INTERACTIONS OF GROWTH HORMONE/PROLACTIN LIGAND AND RECEPTOR FAMILY MEMBERS IN ZEBRAFISH EARLY EMBRYOS

YU Li-Qun1,2, WANG Hou-Peng1, ZHU Zuo-Yan1and SUN Yong-Hua1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Growth hormone (GH) is a member of the GH/Prolactin (PRL) protein super family. It is secreted by anterior pituitary and critically involved in the regulation of cell proliferation, differentiation and migration. Using RT-PCR (reverse-transcription PCR), our previous study revealed that both gh and its receptor gene ghra (growth hormone receptor a) were maternally expressed in zebrafish. This suggested that the GH/GHR signaling pathway might play an important role at the early stage of zebrafish development. To further study the function of GH/PRL signaling pathway in zebrafish embryogenesis, here we characterized and compared the expression patterns of gh/prl and their receptor family members in early embryonic development using real-time PCR and in situ hybridization. We found that the ligand family members, gh and somatolactin (smtl), and the receptor gene family members, ghra and ghrb, were maternally expressed in zebrafish. The analysis of spi2.1 promoter activity indicated the cross-interaction between various ligand family members and GHRa in the early embryos of zebrafish. Our results demonstrated the important role of the GH/PRL family signaling pathway in the early development of zebrafish.

Growth hormone; Growth hormone receptor; GH/PRL family signaling pathways; Zebrafish; Early expression

Q344+.1

A

1000-3207(2014)05-0809-10

10.7541/2014.122

2013-05-02;

2014-01-02

科技部973計(jì)劃課題(2010CB126306); 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30972248、2011FBZ23)資助

于力群(1987—), 男, 山東煙臺(tái)人; 碩士研究生; 主要研究方向遺傳學(xué)。E-mail: biologyu@gmail.com

孫永華, 研究員; E-mail: yhsun@ihb.ac.cn