丙泊酚及其代謝物血藥濃度分析方法研究進展

李莉 李培

新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011

丙泊酚及其代謝物血藥濃度分析方法研究進展

李莉 李培

新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011

丙泊酚是一種短效、速效靜脈麻醉劑。由于丙泊酚起效極快且麻醉后舒適感較好，因此廣泛用于臨床。本文對丙泊酚及其代謝物血藥濃度分析方法的研究現(xiàn)狀做一綜述，講述了幾種定量分析方法，主要有液相色譜法（LC）、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）或液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）。分別闡述了各方法的特點及應(yīng)用前景，并提出了今后丙泊酚及其代謝物分析方法的發(fā)展方向。

丙泊酚；血藥濃度；分析方法；進展

丙泊酚（異丙酚，2，6-二異丙基苯酚）是一種短效靜脈麻醉劑，于1970年發(fā)現(xiàn)，1977年首次臨床試驗，1989年經(jīng)FDA批準進入臨床應(yīng)用，其作用特點是起效極快，一般推注20 s就能使人失去意識。由于丙泊酚具有起效快、誘導平穩(wěn)、持續(xù)時間短、蘇醒快而完全、沒有咳嗽、呃逆等特點，幾乎能夠完全符合靜脈麻醉藥的“黃金標準”，被人稱為“跨世紀”的新型麻醉藥。因而，被廣泛應(yīng)用于手術(shù)期的麻醉誘導、麻醉維持、重癥監(jiān)護患者鎮(zhèn)靜、人工流產(chǎn)及膿腫切開術(shù)等短小手術(shù)。此外在進行胃鏡、腸鏡、支氣管鏡等操作時也可靜注丙泊酚以減輕患者的不適感[1-2]。

丙泊酚作為麻醉劑，具有許多優(yōu)點，但也有一些其不良反應(yīng)的報道。丙泊酚的推注速度過快會導致意識不清、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、低血壓、氣道阻塞、血氧飽和度下降[3]；長期使用丙泊酚會導致心肺功能下降[4]；丙泊酚給藥劑量過高會導致高三酰甘油血癥、低血壓、心動過緩和呼吸驟停[3-4]；還有很高的急性中毒的風險和潛在的致命毒性[3]；其他的不良反應(yīng)包括驚厥反應(yīng)和強大的麻醉后遺效應(yīng)[5]。

由于丙泊酚具有高親脂性、酸性[4]和不穩(wěn)定性[7]等特點，因此需要選擇性強、快速、靈敏度高的分析方法。由于血液較腦脊液方便易得，因此常常研究血藥濃度與其藥理作用之間的相關(guān)性[8]。丙泊酚與血中的蛋白質(zhì)和紅細胞的結(jié)合性很強，因此全血是優(yōu)先選擇的生物樣品[3，7，9]。國內(nèi)外已有很多文獻介紹了丙泊酚及其代謝物的血藥濃度分析方法，下面將對丙泊酚及其代謝物的分析方法做一綜述，詳述各方法的特點及應(yīng)用前景，為今后丙泊酚及其代謝物分析方法的發(fā)展方向提供參考。

1 丙泊酚及其代謝物的結(jié)構(gòu)

丙泊酚具有較高的代謝清除率，其以葡萄糖醛酸代謝物的形式或在其苯環(huán)羥基化之后迅速從體內(nèi)消除[1-2，6]。由于丙泊酚以葡萄糖醛酸代謝物的形式代謝或其苯環(huán)通過葡萄糖醛酸羥基化，因此其在血中的消除速度很快[1-2，6]。已有文獻給出了丙泊酚及其代謝物的結(jié)構(gòu)[2]。見圖1。

2 丙泊酚的血藥濃度分析方法

對于丙泊酚的血藥濃度分析方法，國內(nèi)外已有很多報道，主要有高效液相色譜法（HPLC）[1，4，8-23]和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）[3，6，24]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/ MS）也已用于丙泊酚的血藥濃度檢測，有不經(jīng)衍生化的大氣壓化學分離（APCI）[25]以及經(jīng)衍生化[26]的電噴霧電離（ESI）這兩種。

2.1 高效液相色譜法

在所有的丙泊酚血藥濃度分析方法中，HPLC法應(yīng)用最廣。本文從檢測器、內(nèi)標、樣品的預處理方式、色譜柱、流動相的選取這幾個方面對高效液相色譜法進行了總結(jié)，見表1。

2.2 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

GC/MS在分析丙泊酚的血藥濃度方面應(yīng)用也較廣，僅次于高效液相色譜法，尤其是近幾年應(yīng)用較多。本文從儀器、內(nèi)標、樣品的預處理、色譜柱、溫度條件的選取這幾個方面對氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行了總結(jié)。見表2。

2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

LC-MS/MS在丙泊酚的血藥濃度分析方面是比較新的分析手段，儀器中常使用的離子源有電噴霧電離源（Electrospray Ionization，ESI）和大氣壓化學電離源（Atmospheric pressure chemical Ionization，APCI）兩種。筆者從儀器、內(nèi)標、樣品的預處理、色譜柱、流動相的選取這個方面進行了總結(jié)。見表3。

圖1 丙泊酚及其代謝物的結(jié)構(gòu)

表1 高效液相色譜法分析血樣中丙泊酚濃度

表2 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析血樣中丙泊酚濃度

表3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析血樣中丙泊酚濃度

表1～3總結(jié)了丙泊酚血藥濃度的分析方法。從表中可以看出進行血樣分析，要選擇適宜的內(nèi)標、適宜的樣品預處理方法、適宜的檢測儀器等。此外，評價一種分析方法合適與否，還需對其進行驗證。

2.4 內(nèi)標的選取

不論是HPLC和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，還是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，均需要內(nèi)標，因此選擇合適的內(nèi)標對于校正丙泊酚的血藥濃度十分重要[7，22]。文獻報道測定丙泊酚血藥濃度的內(nèi)標有很多，如水楊酸異丁酯[4]、乙基罌粟堿[6]、2-叔丁基-6-甲基苯酚[7]、卡馬西平[11]、蒽酮[12]、2，4-二叔丁基苯酚[22]、丁香酚苯酚）[26]等，麝香草酚（百里酚）是最常用的一種內(nèi)標[1，8-10，13-21]。

2.5 提取方法的選取

不論是HPLC和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，還是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在檢測分析以前，均需要進行樣品的預處理。丙泊酚血樣的預處理主要有有機溶劑萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法。在進行LC-MS/MS的ESI-MS時還需進行衍生化。詳述如下：

對于有機溶劑萃取法，文獻報道的具有較好的提取回收率的有機溶劑有：如氯仿-乙酸乙酯[3]、環(huán)己烷[8-9，14，24]、環(huán)己烷和正丁醇的混合液[10]、環(huán)己烷和氫氧化四甲基銨（TMAH）的混合液[1，9，16]、二氯甲烷[11]。裂解細胞后，用乙腈-甲醇進行兩步萃取比單純使用甲醇、環(huán)己烷、環(huán)己烷和氫氧化四甲基銨或氫氧化四乙基銨、乙腈萃取的提取回收率高20%[22]。

對于蛋白沉淀法，常見的沉淀劑有乙腈[7，19，26]、甲醇[12，15，21，23]、高氯酸甲醇溶液[13]、高氯酸溶液[17]、飽和硫酸銨溶液[18]、三氯乙酸甲醇溶液[20]、乙腈甲醇混合液[22]。目前，在分析毒理學領(lǐng)域，不推薦使用諸如氯仿之類的有害溶劑。此外，由于丙泊酚的不穩(wěn)定性，科研工作者嘗試了很多方法來減少預處理過程中丙泊酚和內(nèi)標物的損失，如在N2流下加速其揮發(fā)[1，4，7，19，22，25]進程和在蒸發(fā)濃縮前加入TMAH稀釋液來降低丙泊酚和麝香草酚的損失[1，9，16]。因為如果未加入TMAH稀釋液，會有75%的丙泊酚和45%的麝香草酚在揮干的過程中損失掉[1]。此外，還有研究表明，用2-氟-1-甲基-吡啶-p-甲苯磺酸鹽和三乙基胺[7]和丹磺酰氯的衍生化作用[26]對丙泊酚進行衍生化，也可有效防止丙泊酚在樣品制備過程中損失掉。經(jīng)丹磺酰氯衍生化后，丙泊酚的信號強度明顯比未衍生化的正負ESI的信號強度強[26]。

對于固相萃取法（SPE），固相萃取柱的種類有C18固相萃取柱、親水親油平衡（HLB）和Oasis MAX固相萃取柱[2，4，25]。固相萃取柱由甲醇和水活化[2，4，25]。當血樣進入固相萃取柱后，柱子以水，接著是含有1%的KHCO3（乙腈∶水1∶9）、乙腈∶水（2∶3）[25]、甲醇和2%氨水的混合液（5∶95，V/V）[2]以及乙腈和磷酸鹽緩沖液（pH 3.0）的混合液（6∶4）[4，25]清洗3次，除雜。用甲醇、乙腈或乙腈/甲醇（75∶25 V/V）進行第1次洗脫，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25 V/V）[2]進行第2次洗脫，脫附。

2.6 檢測方法的選取

在丙泊酚的血藥濃度檢測中，最常使用的是配有紫外檢測器（UV）[4，8-15]和熒光檢測器（Flu）[1，16-23]的液相色譜儀。GC/MS技術(shù)[3，6，24]也可用于檢測丙泊酚的血藥濃度。在GC/MS中，用來識別丙泊酚和麝香草酚的碎片離子峰如下：丙泊酚為m/z 163，178，117；麝香草酚藍為m/z 135，150，91[3]。對于LC-MS/MS技術(shù)，丙泊酚和麝香草酚分別在APCI MS/MS和ESI MS/MS的177.2～161.2和149.2～133.0檢測到各自的碎片離子峰。Bajpai等[27]更傾向于使用APCI而非ESI。因為APCI增強了丙泊酚的響應(yīng)信號，而丙泊酚的相應(yīng)信號通常是很弱的。此外，Bajpai等[27]發(fā)現(xiàn)丙泊酚能產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間原子團，這種作用降低了離子的豐富性和再現(xiàn)性。

2.7 血藥濃度檢測的方法學驗證

為證明某一分析方法的適用性，需進行方法學驗證。驗證參數(shù)包括：選擇性、特異性、線性、準確度、精密度、穩(wěn)定性、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）和基質(zhì)效應(yīng)等。因此，分析方法是否適用于丙泊酚的血藥濃度檢測也要進行方法學的驗證。血中丙泊酚的LOD和LOQ分別是0.002～0.2和0.002～0.4 μg/mL[1，3-4，6-9，16，19，22，25-26]。方法學驗證參數(shù)，如準確度、精密度、專一性、LOD、LOQ、線性、穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)等都已在文獻中考察。日內(nèi)、日間精密度和準確度均＜10%[1，4，22，25-26，28]。對于LC-MS/MS法而言，考察基質(zhì)效應(yīng)很重要，因為其會明顯的影響血樣中丙泊酚濃度在定量時的準確度和精密度。Thieme等[7]使用內(nèi)標物tBuMPh來有效地解釋說明血中的基質(zhì)效應(yīng)和其他相關(guān)基質(zhì)。Beaudry[26]考察了6種不同血樣的基質(zhì)效應(yīng)，并未發(fā)現(xiàn)有顯著性差別。對于穩(wěn)定性試驗，Binert等[1]考察了含有丙泊酚的血樣的保存條件，發(fā)現(xiàn)最適宜的儲存溫度為4℃，且在該條件下可分別保存60 d。含丙泊酚的血樣不宜存放在-20℃條件下[1]，因為這樣會導致丙泊酚的含量明顯降低。另外一項研究發(fā)現(xiàn)，含丙泊酚的大鼠血漿可在-80℃下保存7周。此外，3次及3次以上的凍/融樣品與剛制備的樣品相比，丙泊酚的濃度無顯著性差別[26]。

表4 血中丙泊酚代謝物的分析方法

3 血中丙泊酚代謝物的分析方法

對于血中丙泊酚代謝物的分析方法，文獻報道不多?？梢圆榈降膸追N分析方法同血中丙泊酚的血藥濃度分析方法，只是具體條件不同。分析方法有：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[2]、高效液相色譜法[29]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[30]，見表4。

表4總結(jié)了血中丙泊酚代謝物的分析方法。血中檢測的丙泊酚的代謝物有PG、4-OH-P、2，6-二異丙基-1，4-二醌、1-QG和4-QG[2]。為了充分地分析丙泊酚的代謝物，相比于丙泊酚的分析手段，還需要不同的樣品預處理方式、其他內(nèi)標物或額外的衍生化。例如，以乙腈/甲醇（75∶25，V/V）進行第1次洗脫，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25，V/V）進行第2次洗脫來得到丙泊酚，以麝香草酚藍為內(nèi)標。另一方面，在以SPE為基礎(chǔ)的制備中，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25，V/V）進行第2次洗脫來得到PG、1-QG和4-QG，以苯基-β-D-葡萄糖苷酸為內(nèi)標[2]。在LC-MS/MS中，流動相中含有甲醇會使丙泊酚和麝香草酚藍的離子化加強，如流動相為甲醇-水（75∶25，V/V），且含有0.025%的NH4OH[2]。

4 小結(jié)

丙泊酚的血藥濃度分析方法主要是HPLC法。HPLC法的優(yōu)點很多，如其應(yīng)用范圍廣，70%以上的有機化合物均可用高效液相色譜分析，特別是對于高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，更具優(yōu)勢；分離效能高，可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果；分析速度快，通常分析一個樣品在15～30 min，一般小于1 h，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成；靈敏度高，紫外檢測器可達0.01 ng。此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點。高效液相色譜儀價格也相對便宜，但檢測器的靈敏度不及氣相色譜，不能用于檢測體內(nèi)含量低的某些藥物及代謝產(chǎn)物。

GC/MS法也可用于分析血中丙泊酚及其代謝物。GC/MS法具有高靈敏度、高分離效率的特點，且易用、耐用、成本低，可選擇性地分析和檢測大量痕量代謝物質(zhì)和同分異構(gòu)體等。只是該法要求分析物必須具有揮發(fā)性，而大部分代謝物是不能揮發(fā)的，這就要需要繁瑣復雜的衍生化過程，而這又會導致分析結(jié)果的多變性，使色譜圖復雜化，影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性。

LC-MS/MS是近幾年開始使用的分析方法，該技術(shù)將色譜對樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合，實現(xiàn)了色譜與質(zhì)譜的優(yōu)勢互補，廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境分析、食品分析等多個領(lǐng)域。但是由于該法成本較高，并且不能同時測定多種物質(zhì)含量，因此其在醫(yī)藥工業(yè)方面的應(yīng)用受到限制。

由此可見，HPLC法、GC/MS法、LC-MS/MS法各有其優(yōu)缺點。理想中的分析方法是快速、靈敏度高、回收率高、變異系數(shù)小、專一性強且成本低，滿足所有要求的分析方法還有待于進一步探索。

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Research progress of analytical methods for the determination of Propofol and its metabolites in blood

LI LiLI PeiCollege of Pharmacy,Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi830011,China

Propofol is a short-acting,fast-acting intravenous anesthetic.Because of Prppofol anesthesia fast and the patients feel comfortable after anesthesia,so it is widely used in clinical surgery.This review reports on the analytical methods for the determination of Propofol and its metabolites in blood,including liquid chromatography(LC),gas chromatography/mass spectrometry(GC/MS),or LC coupled with tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).Method's features，application prospects and technical developments are also discussed.

Propofol;Concentration in blood;Analysis;Research

R969.1

A

1673-7210（2014）11（b）-0160-05

2014-08-15本文編輯：程銘）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目（編號2014211C010）。

李培（1990.7-），女，新疆醫(yī)科大學藥物分析專業(yè)2012級在讀碩士研究生。

李莉（1963.3-），女，博士，教授，博士生導師；研究方向：藥物分析。