擠壓膨化對玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響*

鄭喜群 馬艷秋 劉曉蘭 楊雙 李凱園

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006; 2.齊齊哈爾大學(xué)黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006)

2012年中國玉米產(chǎn)量為2.01億噸，首次超過稻谷，成為第一大糧食作物.以玉米為原料濕法生產(chǎn)淀粉時，可分離出相對玉米(干基)6%左右的副產(chǎn)物玉米蛋白粉(CGM)，CGM的主要成分是玉米蛋白(55%～65%)，其中玉米醇溶蛋白占總蛋白的65%～68%.

與其他谷物蛋白相比，玉米醇溶蛋白含有高比例的亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，具有獨(dú)特的抗氧化［1］、抗高血壓［2］和促酒精代謝［3］功能序列，是一種潛在的功能性蛋白原料.但玉米醇溶蛋白是高度緊密及疏水的“醇溶蛋白體”，蛋白結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定［4］，功能性難以釋放，可采用必要的加工方法及技術(shù)手段，改變天然玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，改善其功能特性.

擠壓膨化技術(shù)具有效率高、用時短、操作簡單且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中［5］.蛋白質(zhì)的擠壓膨化是指在高溫、高壓、高剪切力及高能量水分子的協(xié)同作用下，其高級結(jié)構(gòu)的去折疊、線性化和再交聯(lián)的過程［6］.研究發(fā)現(xiàn)適度擠壓膨化可以改善玉米蛋白的吸水性、乳化性等物理性質(zhì)［7］;同時，擠壓膨化也可以改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，增加其對蛋白酶的敏感性［8］.

文中采用掃描電子顯微鏡、差示量熱掃描法及傅里葉紅外光譜等技術(shù)手段對擠壓膨化前后玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究，并分析其物性的變化情況.以期為玉米醇溶蛋白的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米蛋白粉(蛋白含量為57.07%)由黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司提供，8-苯胺-1-萘磺酸(ANS，色譜純)和5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(Ellman's試劑，色譜純)購于Sigma公司，大豆油為市售，其他試劑均為分析純試劑.

DS32-Ⅱ型雙螺桿擠壓膨化機(jī)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn);Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，PE公司生產(chǎn);Q-20型差示量熱掃描儀，TA儀器公司生產(chǎn);Nano-ZS90激光散射儀，Malvern儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CGM的擠壓膨化及醇溶蛋白的提取

將CGM含水量調(diào)節(jié)至16%，放置過夜.膨化機(jī)工作參數(shù)為160～180℃、1.0～1.5 MPa.膨化的CGM在室溫下干燥，用粉碎機(jī)粉碎、篩分，收集粒徑小于280μm的膨化CGM作為原料備用.

將收集的CGM加入到70%乙醇水溶液(質(zhì)量/體積比為1∶10，g/mL)中，置于水浴磁力攪拌器中，60℃萃取2h，4500 r/min離心10 min，收集上清液，將沉淀按上述方法再次提取.將兩步提取的上清液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/3，析出沉淀即為玉米醇溶蛋白，冷凍干燥.

1.2.2 玉米醇溶蛋白表觀結(jié)構(gòu)的觀察

應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)考察玉米醇溶蛋白表觀結(jié)構(gòu).將少量蛋白樣品固定到樣品臺上，噴金鍍膜處理，用電子顯微鏡觀察.電鏡工作參數(shù)為:離子濺射儀工作距離為50mm，真空度為0.05mbar，電流控制為30 mA，濺射時間為40～60 s，噴金厚度大于5nm.

1.2.3 玉米醇溶蛋白紅外光譜的測定

將蛋白樣品進(jìn)行KBr壓片制樣，用傅里葉紅外光譜儀測定波數(shù)為4000～400 cm-1的蛋白紅外光譜，分辨率為4cm-1，波數(shù)精度為0.01cm-1，掃描次數(shù)為32次，環(huán)境溫度為25℃.利用Omnic V 8.0軟件對譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)、去卷帙及曲線擬合處理.

1.2.4 玉米醇溶蛋白變性溫度的測定

利用Q-20型差示掃描量熱儀測定.實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整蛋白水分含量為6%，稱取約2.0 mg玉米醇溶蛋白放入鋁盒中，密封，置于DSC儀器的樣品支持器上，以密封空鋁盒作為對照.氮?dú)鈮毫?.05 MPa，升溫速率為10℃/min，溫度范圍20～180℃.每個樣品重復(fù)測定3次.

1.2.5 玉米醇溶蛋白表面疏水性的測定

取約0.1g玉米醇溶蛋白，溶于5mL 0.01mol/L pH=7.0的磷酸-磷酸鹽緩沖液中，4000 r/min離心10min，收集上清液.測定上清液可溶性蛋白含量，稀釋蛋白使其含量為0.008～0.500 mg/mL.取4mL樣液加入20 μL 8 mmol/L ANS熒光探針試劑，在室溫條件下避光反應(yīng)15min.在激發(fā)波長390nm、發(fā)射波長470nm以及狹縫5nm的條件下，測定ANS結(jié)合物的相對熒光強(qiáng)度，最后以相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度作為橫坐標(biāo)作圖，以其斜率表示樣品的表面疏水性.

1.2.6 玉米醇溶蛋白游離巰基含量的測定

參照Ellman’s分光光度法，有改動.精確稱取0.05g蛋白樣品，加入到8 mL含有8 mol/L尿素的pH值為8.0的Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09mol/L glycine、0.004 mol/L EDTA)中，攪拌溶解1h，10000r/min離心10min，收集上清液.取2mL上清液加入2mL緩沖液和40μL Ellman’s試劑，立即混勻，1h后測定412 nm吸光值，以不加樣品、只加Ellman’s試劑為空白.基于Ellman’s試劑-SH的摩爾吸光系數(shù)1.36×104，計算玉米醇溶蛋白的游離巰基含量Y(μmol/g)，公式如下:

式中:D為412 nm吸光值;ρ為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL;d為稀釋倍數(shù).

1.2.7 玉米醇溶蛋白持水力和吸油性的測定

將0.5g玉米醇溶蛋白和5mL蒸餾水或精制大豆油放入10mL的離心管中，攪拌均勻，靜置30min，在3000r/min離心10min，棄去上清液，然后測量離心管和殘留物的質(zhì)量.持水力或吸油性F按下式計算:

式中，m0為干燥樣品的質(zhì)量，m1為干燥樣品和離心管的總質(zhì)量，m2為離心后殘留物和離心管的總質(zhì)量.

1.2.8 玉米醇溶蛋白溶解性的測定

參考Surowka的質(zhì)量差法，有改動.將烘干后的10mL離心管標(biāo)記、稱重，然后稱取玉米醇溶蛋白0.5g，放入離心管中.再向離心管中加入5 mL蒸餾水，漩渦振蕩10 min后，10000 r/min離心10 min，棄去離心上清液，將沉淀物放入真空干燥箱中(80℃)干燥至衡重.將帶有沉淀物的離心管稱重，按下式計算溶解性R:

式中，m為玉米醇溶蛋白干物質(zhì)質(zhì)量，m'1為空離心管的質(zhì)量，m'2為離心管和沉淀物的質(zhì)量.

1.2.9 玉米醇溶蛋白黏度的測定

用70%乙醇水溶液配置1%的玉米醇溶蛋白溶液.采用DV-C黏度計測定黏度，轉(zhuǎn)子選擇S96，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，記錄扭矩在20%～80%之間的黏度值穩(wěn)定時的數(shù)據(jù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)都是3次測定的平均值，采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用origin 8.6統(tǒng)計學(xué)軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米醇溶蛋白的表觀結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的玉米醇溶蛋白，蛋白純度分別為(94.26±0.43)%和(95.92±0.37)%.掃描電子顯微鏡利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子與被散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌信息.玉米醇溶蛋白的掃描電鏡圖像見圖1

圖1 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白SEM圖片F(xiàn)ig.1 SEM photos of zein without and with extrusion

由圖1可見，未處理的玉米醇溶蛋白聚集體直徑較小(0.1～3.0μm)，蛋白質(zhì)聚集體呈現(xiàn)球狀，球的大小不等，表面十分光滑，分布均勻，蛋白質(zhì)聚集體之間有明顯的界限.Yamada等［9］用掃描電鏡觀察玉米醇溶蛋白時也發(fā)現(xiàn)，在乙醇溶液中蛋白聚集形成小球狀，小球直徑為 150～550 nm，高度為50～150nm.玉米醇溶蛋白經(jīng)擠壓膨化處理后，除了球狀聚集體之外，多數(shù)聚集體之間的界限變得不明顯，部分呈現(xiàn)棒狀結(jié)構(gòu);球狀與球狀聚集體、球狀與棒狀聚集體、棒狀與棒狀聚集體融合在一起，形成較大的聚集體.這種聚集體可能是蛋白間形成二硫鍵導(dǎo)致的.

2.2 玉米醇溶蛋白紅外光譜

Omnic V 8.0軟件處理后的玉米醇溶蛋白的紅外光譜見圖2，譜圖中的吸收峰與分子中各基團(tuán)的振動形式相對應(yīng)，3000～3 600 cm-1處出現(xiàn)一吸收峰，這主要是蛋白質(zhì)的O—H和N—H的伸展擺動，是酰胺A和酰胺B帶的N—H的伸縮振動;在3000～2800cm-1處也有吸收峰，主要是C—H鍵的伸展搖擺.

蛋白質(zhì)的FT-IR光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶，1600cm-1附近出現(xiàn)酰胺I吸收帶，即C==O的伸縮振動;1530cm-1附近是酰胺Ⅱ吸收帶，即C—N伸縮振動或N—H的彎曲振動;1450 cm-1主要來源于甲基的不對稱和對稱變角振動吸收;1230cm-1附近為酰胺Ⅲ吸收帶，主要是C—N的伸縮振動和N—H的彎曲振動.

圖2 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of zein without and with extrusion

由圖2可知，與未處理的玉米醇溶蛋白相比，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的酰胺帶出峰位置與強(qiáng)度均發(fā)生了改變，其中酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰位置向低波數(shù)方向發(fā)生移動，酰胺Ⅲ帶則向相反方向移動.同時擠壓膨化處理的玉米醇溶蛋白在1632cm-1與1243cm-1處峰強(qiáng)度有明顯的增加，其均為β折疊的出峰位置，表明β折疊含量有所增加，與酰胺Ⅰ帶擬合結(jié)果相符.

CGM除了含有55%～65%的蛋白質(zhì)之外，還含有21%～26%的碳水化合物，其中淀粉占12%～15%.這些淀粉與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密.未處理的醇溶蛋白在1150～1020cm-1處出現(xiàn)多糖的吸收峰，表明醇溶蛋白含有一定量的多糖，Tatiana等［10］報道的γ-玉米醇溶蛋白的紅外光譜中也出現(xiàn)了這一吸收峰;而擠壓膨化的玉米醇溶蛋白在1150～1020 cm-1處出現(xiàn)多糖的吸收峰，表明擠壓膨化過程減弱了蛋白與多糖之間的連接力，使提取的醇溶蛋白含多糖量顯著減少.

紅外光譜可用于研究蛋白二級結(jié)構(gòu)，1 600～1700cm-1為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)吸收峰的疊加，因此基于紅外光譜的酰胺Ⅰ帶曲線擬合技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析.對玉米醇溶蛋白光譜中1600～1700 cm-1吸收帶進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)及去卷帙處理，經(jīng)過處理后疊加峰得到了分離，根據(jù)分辨出來的子峰，對原始吸收峰進(jìn)行高斯曲線擬合，擬合圖譜見圖3.

由圖3可知，玉米醇溶蛋白在1600～1700cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個子峰，定義子峰面積百分比為它的面積除以各個子峰面積的總和，根據(jù)朗伯比耳定理，這個子峰的面積百分比就可看做是這個子峰所代表的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)中的相對含量.根據(jù)Byler、Smeller等［11-12］對多種蛋白紅外光譜的研究結(jié)論，確定玉米醇溶蛋白中各個子峰位置與二級結(jié)構(gòu)成分的對應(yīng)關(guān)系，得到各個子峰的吸收頻率位置、子峰相對面積及二級結(jié)構(gòu)見表1.

由表1可知，本實(shí)驗(yàn)工作參數(shù)下，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，未處理玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量分別為23.68%、13.10%、47.59%及15.63%，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量分別為19.60%、22.56%、 36.27%和21.58%.擠壓膨化使玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋與β轉(zhuǎn)角含量減少，β折疊和無規(guī)則卷曲含量增加.擠壓膨化使玉米醇溶蛋白分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)了由螺旋向折疊轉(zhuǎn)化的趨勢，同時伴隨著無卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，表明玉米醇溶蛋白整個分子構(gòu)象從有序向無序轉(zhuǎn)化.由于二級結(jié)構(gòu)的變化，天然玉米醇溶蛋白高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，對蛋白改性的敏感性增加.

圖3 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白 FT-IR酰胺Ⅰ帶分解和曲線擬合Fig.3 Decomposition and curve fitting for FT-IR of zein without and with extrusion in amide I region

表1 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白在酰胺Ⅰ帶的子峰位置、相對面積及其二級結(jié)構(gòu)含量1)Table 1 The peak position，relative area and their secondary structure assignments of Amide I for zein without and with extrusion

2.3 玉米醇溶蛋白的變性溫度

擠壓膨化玉米醇溶蛋白的DSC曲線見圖4.

圖4 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白DSC曲線Fig.4 DSC curves of zein without and with extrusion

由圖4可知，玉米醇溶蛋白的吸熱曲線均出現(xiàn)兩個吸熱峰，吸熱峰Ⅰ與吸熱峰Ⅱ峰值點(diǎn)溫度分別為蛋白玻璃化溫度(Tg)及變性溫度(Tp).比較可知，擠壓膨化使玉米醇溶蛋白玻璃化溫度升高，變性溫度減小.可能原因是，擠壓膨化使得玉米醇溶蛋白高級結(jié)構(gòu)遭到破壞，空間結(jié)構(gòu)變得松散，熱穩(wěn)定性降低，蛋白變性溫度減小.但該數(shù)值比Pablo等［13］通過DSC方法對大豆蛋白熱變性分析的數(shù)值(Tp=98.9℃)高，表明與大豆蛋白相比，擠壓膨化后的玉米醇溶蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性.

2.4 玉米醇溶蛋白表面疏水性和游離巰基含量的變化

研究表明［14-15］，蛋白的擠壓膨化過程一般不會涉及肽鍵等主要化學(xué)鍵的斷裂或改變，但會在一定程度上改變維系蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的次級健.文中主要研究了擠壓膨化對玉米醇溶蛋白表面疏水性及游離巰基含量的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未處理的玉米醇溶蛋白表面疏水性為(638.62±100.21)，擠壓膨化后該數(shù)值上升為(1191.48±111.24).可能原因是，擠壓膨化過程中，在高溫、高壓及高剪切力的作用下，玉米醇溶蛋白內(nèi)部部分疏水性氨基酸暴露，導(dǎo)致蛋白表面疏水性增加.Park等［14］采用單螺桿擠壓膨化脫脂大豆粉時也觀察到了類似的現(xiàn)象.同時，擠壓膨化使得玉米醇溶蛋白的游離巰基含量由(5.37±0.53)μmol/L減小為(3.49±0.20)μmol/L.可能原因是半胱氨酸在高溫、高壓及高剪切力下形成了二硫鍵.Camire［15］通過研究擠壓蒸煮過程中食品的化學(xué)變化，也報道了相似的結(jié)論.

2.5 玉米醇溶蛋白的物性

擠壓膨化玉米醇溶蛋白的部分物性見表2.

表2 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的物理性質(zhì)Table 2 Physical properties of zein without and with extrusion

由表2可知，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的物理性質(zhì)發(fā)生了變化，持水力、吸油性與黏度均有所升高，但在水相中的溶解性有較顯著的下降.可能的原因?yàn)?擠壓膨化可使蛋白緊密的空間結(jié)構(gòu)變疏松，加強(qiáng)了水與蛋白的結(jié)合作用，持水力增加;也可使蛋白分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性變大，加強(qiáng)了油脂與蛋白的結(jié)合作用，吸油性增加;同時，溶解性下降顯著的原因可能是，擠壓膨化使得蛋白發(fā)生受熱變性和交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致溶解性減小.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)工作參數(shù)下，擠壓膨化使玉米醇溶蛋白部分聚集體發(fā)生融合，球狀聚集體直徑變大;二級結(jié)構(gòu)中的α螺旋與β轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β折疊和無規(guī)則卷曲;蛋白變性溫度、游離巰基含量均變小，表面疏水性增加.蛋白的持水力、吸油性和黏度均有不同程度的增加.擠壓膨化處理使玉米醇溶蛋白的穩(wěn)定性降低，當(dāng)將擠壓膨化作為玉米醇溶蛋白及CGM的改性處理的預(yù)處理步驟時，會使蛋白的改性效果更好.

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