與泌尿生殖竇間質細胞共培養(yǎng)誘導hUC-MSCs定向分化為前列腺上皮樣細胞

李 望，高維強

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院干細胞研究中心，上海200127)

干細胞的生長和分化、成熟與周圍的微環(huán)境有關［1］?？赡艿臋C制是，干細胞在特定的微環(huán)境中受到周圍細胞信號的影響，從而對新的微環(huán)境中的調節(jié)信號做出反應。例如神經干細胞在神經系統(tǒng)內幾乎不增殖，只有當神經出現損傷時，才有可能被激活［2］。有研究表明［3］，心臟干細胞平時也不具有增殖能力，只有在特定的時候才會增殖分化。人的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多潛能的細胞［4］。許多研究報道，這類細胞能夠分化成不同類型的細胞，例如可以分化成中胚層的組織包括骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱和脂肪［5］。近年來人的臍帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成為研究的熱點。由于hUCMSCs 具有組織樣本容易獲得、非侵入性的采集過程、并且采集臍帶沒有倫理道德上的爭議，人們認為hUC-MSCs 是比較原始的細胞且干性更強，比其他組織的MSCs 免疫排斥性低，并且具有更強的可塑性和擴增能力等優(yōu)點［6］。本研究的目的是想探索hUCMSCs 在體外特定的組織細胞微環(huán)境中是否能夠被定向誘導分化成為前列腺上皮細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

PE 偶聯的CD105、FITC 偶聯的CD29、APC 偶聯的CD31、Per-Cy5.5 偶聯的CD45 和PE-Cy7 偶聯的CD34(eBioscience 公司);P63、AR、CK8、PSA 及vimentin 抗體(Santa Cruz 公司);睪酮、膠原蛋白酶IV 和胰蛋白酶(Sigma 公司);isopore 膜(Millipore 公司);膠原蛋白(collagen 膠)(BD 公司)。

1.2 泌尿生殖竇間質細胞的制備

泌尿生殖竇間質細胞的分離過程根據以往的研究報道［7］。從懷孕18 d 的SD 大鼠身上取出胚胎，處死并取下胚胎的泌尿生殖竇。把泌尿生殖竇間質與上皮分離后，把間質組織用1 mg/mL 的膠原蛋白酶Ⅳ聯合0.125%的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，將消化下來的細胞在改良Eagle 培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中分散培養(yǎng)(DMEM 中加入10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素，10－8mol/L 雄激素)。大鼠泌尿生殖竇的間質細胞(rat urogenital sinus stromal cells，rUGSSs)長滿培養(yǎng)皿后用胰蛋白酶消化傳代，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后與hUC-MSCs 聯合進行體外實驗。

1.3 hUC-MSCs 的分離和制備

新鮮的人臍帶從仁濟醫(yī)院產科的剖腹產手術中取得。獲得仁濟醫(yī)院倫理委員會的批準及取得了產婦及親屬同意。臍帶組織在70%的乙醇中消毒30 s并用0.9%氯化鈉注射液徹底清洗。反復清洗直到血和血凝塊洗凈。為了避免內皮細胞的污染，臍血管用0.9%氯化鈉注射液沖洗后用無菌的解剖刀切開。臍血管(動脈和靜脈)移除，將暴露的華通氏膠組織切成小片［8］。切碎成1 ～2 mm3的碎片后用1 mg/mL的膠原蛋白酶IV 聯合0.125%胰蛋白酶在37 ℃消化30 min。將消化之后的細胞用400 ×g 離心8 min，在PBS 中洗2 次。華通氏膠中提取的細胞放在含有8% 胎牛血清、100 U/mL 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。hUC-MSCs 在長滿培養(yǎng)皿后傳代，細胞在體外培養(yǎng)兩周后與大鼠的泌尿生殖竇間質細胞聯合進行體外實驗。

1.4 流式細胞鑒定

使用標準的流式技術分析第4 代hUC-MSCs 細胞。用單陽性對照調補償。細胞先標記CD105、CD29、CD45、CD34 和CD31 抗體后用BD FACSAria流式細胞儀分析細胞的純度。

1.5 體外分化

hUC-MSCs 與大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞混合，重懸在3 g/L 100 μL collagen 膠原蛋白中。將含有細胞的膠原蛋白放置在isopore 膜上(圖3A，B，C)。把膜放在盛有DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加睪酮終濃度在10－8mol/L(0.01 μmol/L)，每3 天更換新的培養(yǎng)基。兩周后收集膠原蛋白并且將其做免疫熒光分析。用前列腺上皮細胞的標志物分析hUC-MSCs 的分化。

2 結果

2.1 hUC-MSCs 和大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞的分離和鑒定

通過膠原蛋白酶聯合胰蛋白酶消化的方法，由人臍帶而來的細胞以1 000 個細胞/cm2的密度種在培養(yǎng)皿中。貼壁細胞呈現典型的成纖維狀或多角形的形態(tài)學特征(圖1A)。泌尿生殖竇的間質細胞較小并且呈成纖維狀的外觀(圖1B)。

為了再次鑒定制備的hUC-MSCs，利用流式分析第4 代細胞。如圖2，hUC-MSCs 表達CD29(圖2D)、CD105(圖2E)，但對于造血譜系的標志物CD34 陰性(圖2F)，白細胞共同抗原CD45(圖2G)陰性，血小板、內皮細胞黏附分子CD31 陰性(圖2H)。流式分析得出CD29、CD105 雙陽性的hUCMSCs 群體占整體的98.7%(圖2C)。

圖1 人臍帶間充質干細胞和大鼠泌尿生殖竇間質細胞的形態(tài)特征Fig 1 The morphology and characterization of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs)and rat urogenital sinus mesenchymal cells(rUGSSs)(×40)

2.2 hUC-MSCs 在體外分化

hUC-MSCs 與大鼠的泌尿生殖竇的間質細胞聯合在三維立體膠中體外培養(yǎng)(圖3A，B，C)，經睪酮誘導兩周后將培養(yǎng)的細胞做免疫熒光分析顯示，一些細胞表達前列腺上皮的標志物。包括基底細胞的標志物CK5(圖3E)和P63(圖3F)、腔細胞的標志物CK8(圖3D)。這些發(fā)現提示，hUC-MSCs 在體外特異的組織細胞微環(huán)境中能夠定向分化。

3 討論

在正常的胚胎發(fā)生當中，前列腺是由泌尿生殖竇發(fā)育而來，泌尿生殖竇起源于泄殖腔的分叉。泌尿生殖竇是一個正中線的結構，由內胚層起源的上皮層和中胚層起源的基質細胞層所構成［9］。前列腺的發(fā)育、生長和細胞分化是由上皮和周圍的間質微環(huán)境相互作用的結果［10］。在前列腺的發(fā)育、成熟過程中，雄激素的存在起了非常重要的作用［11］。這個過程包括間質誘導上皮的發(fā)育，以及上皮在發(fā)育過程中對間質的反作用。

干細胞存在于特定的微環(huán)境細胞中，微環(huán)境能夠給予干細胞營養(yǎng)并且保持組織細胞的穩(wěn)態(tài)。當干細胞存在的微環(huán)境由于某種原因發(fā)生了改變，就會給干細胞發(fā)出某種信號刺激。例如發(fā)出細胞再生的刺激、分化的刺激、凋亡的刺激、或者其他的刺激最終導致干細胞不同的命運［12］。

圖2 流式細胞術檢測人臍帶間充質干細胞免疫表型Fig2 Immuno phenotypes of hUC-MSCs by flow cytometry

圖3 人臍帶間充質干細胞在體外分化Fig 3 Directed differentiation of hUC-MSCs in vitro(×100)

本研究中，利用rUGSSs 給hUC-MSCs 提供了增殖和分化的微環(huán)境，在雄激素的誘導作用下，在與rUGSSs 共培養(yǎng)的條件下分化出了前列腺上皮樣細胞?？赡芗毎盘柾吩诩毎脑鲋澈头只衅鹆酥匾慕巧Ｉ婕暗竭@個過程的信號分子還不太清楚?？傊?，本研究證明，利用hUC-MSCs 處于特異的組織細胞微環(huán)境中能夠定向分化成特定的細胞。利用這種方法可以快速地誘導分化出特定的細胞類型。為組織工程、基礎研究提供一個新的啟示。

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