白藜蘆醇對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞及TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

丁繼存，翟曉翔，唐志銘

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)徐州附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 徐州 221003；2.江蘇省徐州市中醫(yī)院皮膚科，江蘇 徐州 221003)

病理性瘢痕是一種皮膚纖維化疾病，目前認(rèn)為成纖維細(xì)胞凋亡受阻或過度增殖是其發(fā)生的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡的調(diào)控因子[1]，Smads蛋白是其下游信號(hào)分子，能把TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核中。研究[2]表明，TGF-β1/Smads信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有密切的關(guān)系。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種多酚類化合物，具多種生物學(xué)活性及藥理作用。近幾年來的研究[3-4]結(jié)果表明它能通過多種途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，因此起到對(duì)抗增生性疾病的作用。本研究觀察Res對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響，旨在為Res應(yīng)用于臨床治療病理性瘢痕提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：Res(西安冠宇生物技術(shù)有限公司)、DMEM培養(yǎng)基及PBS(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?、D-Hank液(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、0.25%胰蛋白酶-EDTA液(北京Solarbio公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)、Trizol Reagent ( Invitrogen公司)、兔抗人TGF-β1、Smads單克隆抗體( Santa Cruz公司)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(BD Pharmingen公司)。

1.1.2 主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)、高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)、JSM-6510型掃描電鏡(日本電子)、自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek儀器有限公司)、電泳儀(北京六一)、PCR 儀 (上海山富科學(xué)儀器有限公司)、Quantity-one凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、熒光顯微鏡及數(shù)字CCD成像裝置(日本奧林巴斯)、Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.1.3 標(biāo)本來源：實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來自2011年6月—2012年5月徐州市中醫(yī)院皮膚科及燒傷整形科病理性瘢痕手術(shù)患者。標(biāo)本的獲取均征得患者的知情同意，并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)：無菌條件下切取人病理性瘢痕組織標(biāo)本，用眼科剪仔細(xì)剔除上皮及皮下組織，D-Hank洗3遍，然后剪成1mm3大小的組織塊，置于一無菌瓶中。無菌瓶中加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液5mL，封口，搖勻，4℃冰箱冷消化14h；再置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15min，若組織稀疏，邊緣變毛，用200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，其余可以繼續(xù)消化；將濾液離心，1 000r/min，7min，棄上清液；用10%FBS的DMEM液5mL混勻沉淀細(xì)胞，置于一個(gè)25ml的培養(yǎng)瓶中；在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h后，用含10%FBS的DMEM換液，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞接近長(zhǎng)滿時(shí)，按1∶3比例進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)選用第5代細(xì)胞。

1.2.2 掃描電鏡觀察病理性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：接種細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中分為對(duì)照組(A組)和3個(gè)藥物濃度組，即B組(濃度10μmol/L)、C組(濃度50μmol/L)、D組(濃度100μmol/L)，濃度篩選根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞半數(shù)抑制濃度1/3～2/3 范圍時(shí)的Res濃度得出，每組24個(gè)培養(yǎng)孔。用含10%FBS的DMEM液將第5代成纖維細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以1.0×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)板孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，再每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM液180μL，然后3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)濃度的Res 20μL。對(duì)照組則加入含10%FBS的DMEM液20μL。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24h 后,去除培養(yǎng)液,用溫PBS 沖洗3 次以去除未貼壁細(xì)胞,然后用3%戊二醛固定1h后，用PBS洗3次,再用1%四氧化鋨后固定2h,使用不同濃度的乙醇脫水,充分干燥,離子濺射鍍膜儀鍍金,最后在掃描電鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(lán)(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測(cè)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖狀況：按前述方法分組及接種后，將Res用DMSO溶解為所需濃度，分別加入上述3個(gè)藥物濃度組，每孔20μL，對(duì)照組每孔加入1%DMSO/DMEM20μL。藥物干預(yù)24h，每孔加入5mg/mL MTT(用pH 7.4 PBS配制)20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使甲臜結(jié)晶顆粒溶解為均勻的藍(lán)紫色，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔吸光度(OD)值。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)TGF-β1，Smad 2、3、4、7 mRNA的表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法如前。采用Trizol Reagent總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。電泳鑒定提取RNA的完整性。經(jīng)測(cè)定，所有樣本A260/A280均大于1.8，提示樣本純度較高，無明顯蛋白污染。統(tǒng)一調(diào)整總RNA純度為0.5g/L，于-70℃儲(chǔ)存。

取6μL RNA為反轉(zhuǎn)錄模板。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為37℃1h，95℃3min。標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法制備cDNA模板標(biāo)準(zhǔn)品，依次10倍梯度稀釋，制備成5個(gè)梯度的cDNA模板定量標(biāo)準(zhǔn)品。在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express 2.0軟件，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列見表1。

表1 TGF-β1、Smads基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度Table 1 TGF-β1,Smads gene primer sequences and amplification fragment length of the product

PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件，93℃預(yù)變性3min，93℃變性30s，57℃退火30s，共循環(huán)30次，72℃延伸5min。取6μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用Quantity-one凝膠成像分析系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，以各目的基因與內(nèi)參基因β-actin的灰度值比值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)TGF-β1，Smad 2、3、4、7蛋白的表達(dá)：用上述方法培養(yǎng)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞24h后，吸去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫下固定30min，用PBS洗滌3次，0.1%Triton X-100 37℃孵育20min，PBS洗滌，非免疫山羊血清封閉1h，吸凈血清后加入TGF-β1、Smads一抗(1∶100)4℃孵育過夜，次日PBS沖洗后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育60min，PBS沖洗，DAPI避光復(fù)染，10min后熒光顯微鏡下觀察，用數(shù)字電荷耦合元件(charge-couple device,CD)成像裝置采集圖像，Image Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察病理性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：對(duì)照組成纖維細(xì)胞鋪展良好，細(xì)胞間鑲嵌連接，相鄰細(xì)胞的間隙很窄，胞膜完整，表面微絨毛豐富，卷曲成叢狀，規(guī)則排列(圖1A，1B)。用10μmol/L Res處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞48h后，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞明顯回縮，鋪展面積減小(圖2A)，細(xì)胞表面的微絨毛逐漸消失(圖2B),膜表面可見出泡現(xiàn)象(圖2C)，最后胞體固縮,細(xì)胞裂解成許多胞膜完整、大小不一的凋亡小體狀結(jié)構(gòu)(圖2D)。在50μmol/L和100μmol/L Res作用下，細(xì)胞的變化與上述情況相似。

2.2 MTT法檢測(cè)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增生狀況：以不同濃度的Res處理病理性瘢痕成纖維細(xì)胞后，采用MIT法檢測(cè)其增殖情況，結(jié)果顯示，各不同藥物濃度組與對(duì)照組相比，OD值均明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明Res對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，并且這種抑制作用有劑量依賴性。見表2。

GroupsConcentrationsOD valueA-0.485±0.034 B10μmol/L0.324±0.017?C50μmol/L0.267±0.014? D100μmol/L0.173±0.009?

*P<0.05vsgroup A byqtest

2.3 RT-PCR檢測(cè)各組TGF-β1、Smads mRNA的表達(dá)：提取的總RNA經(jīng)紫外線分光光度儀測(cè)定其濃度及純度，RNA 的A260/A280值為1.8～2.0，表明純度良好。RNA變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。圖中各電泳條帶顯示，28S和18S區(qū)帶清晰集中，表明未被降解，RNA完整性好。

病理性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)10、50、100μmol/L的Res干預(yù)后，其TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，而Smad 7 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4及表3。Pearson相關(guān)性分析表明，TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Res干預(yù)濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.869，P=0.02；r=-0.749，P=0.03；r=-0.751，P=0.03；r=-0.695，P=0.04)，Smad 7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Res干預(yù)濃度呈正相關(guān)(r=0.882,P=0.02)。

GroupsTGF-β1Smad 2Smad 3Smad 4Smad 7A1.54±0.121.71±0.141.62±0.131.47±0.080.68±0.04B1.49±0.15?1.66±0.11?1.55±0.08?1.40±0.15?0.82±0.03?C1.38±0.17?1.48±0.09?1.44±0.16?1.32±0.10?1.17±0.07?D1.14±0.07?1.23±0.08?1.31±0.07?1.12±0.08?1.23±0.10?

*P<0.05vsgroup A byqtest

2.4 免疫熒光檢測(cè)各組TGF-β1、Smads蛋白表達(dá)：Res各濃度組TGF-β1，Smad 2、3、4 熒光強(qiáng)度隨著Res的干預(yù)濃度升高而降低，呈負(fù)相關(guān)(r=-0.921，P=0.02；r=-0.913，P=0.02；r=-0.843，P=0.03；r=-0.865，P=0.03)，而Smad 7熒光強(qiáng)度隨著Res的干預(yù)濃度升高而增強(qiáng)，呈正相關(guān)(r=0.854,P=0.03)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

GroupsTGF-β1Smad 2Smad 3Smad 4Smad 7A36.23±3.2828.97±3.1134.35±2.9631.16±3.6523.09±2.78B32.43±2.54?25.32±3.17?30.45±2.84?28.32±3.06?29.11±3.19?C27.13±3.19?21.14±2.88?26.95±3.12?25.18±3.23?35.52±3.62?D21.47±2.77?17.37±3.04?21.86±2.42?20.37±2.95?38.83±3.51?

*P<0.05vsgroup A byqtest

3 討 論

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，以真皮成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生過量的胞外基質(zhì)(Ⅰ、Ⅲ型膠原，黏蛋白和黏多糖等)為特點(diǎn)[5],是一種皮膚結(jié)締組織增生性疾病。本病常發(fā)生在燒傷、外科手術(shù)及外傷后，不僅影響美觀，甚至可以引起嚴(yán)重的功能障礙。目前病理性瘢痕的治療方法較多，但因其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，故治療沒有取得突破性進(jìn)展[6]。因此，通過更深入的揭示病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制，并尋找一種新的有效的防治病理性瘢痕的天然藥物是皮膚外科領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。

Res是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，是植物在受到真菌感染、紫外線照射或病理狀況下產(chǎn)生的植物防御素。它具有廣泛的生物學(xué)活性和多種藥理作用，如抗腫瘤、抑制血小板聚集、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌抗病毒[7]。此外，它能通過多種途徑抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，因此起到對(duì)抗增生性疾病的作用。但Res是否能夠抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，目前鮮有報(bào)道。

病理性瘢痕發(fā)生的主要病理學(xué)基礎(chǔ)是成纖維細(xì)胞凋亡不足或受阻，導(dǎo)致其增殖相對(duì)過度。TGF-β1參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡，是目前公認(rèn)的與病理性瘢痕形成密切相關(guān)的最重要的細(xì)胞因子之一。Smads蛋白是TGF-β1的下游信號(hào)分子，能把TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核中。Smads家族蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為3類[8]：受體調(diào)節(jié)型Smad(Smad 1、2、3、5、8)、共同型Smad(Smad 4)、抑制型Smad(Smad 6、7)。研究[9]表明，TGF-β1/Smads信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有密切的關(guān)系。在細(xì)胞凋亡過程中，TGF-β1首先與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，進(jìn)而磷酸化胞質(zhì)內(nèi)的受體調(diào)節(jié)型Smads,即Smad 2、3，磷酸化的Smad 2、3再與Smad 4形成異三聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子共同作用或獨(dú)立調(diào)控下游特異基因的表達(dá)。

有研究[10]表明miR-200c可通過降低磷酸化Smad 2和Smad 3的蛋白表達(dá)水平來抑制經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的人瘢痕疙瘩纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，因此TGF-β1/Smads信號(hào)通路與病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Res是否能通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路來對(duì)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增值、凋亡產(chǎn)生影響，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)還沒有這方面的研究報(bào)道。因此，本課題組對(duì)此進(jìn)行了一些探索。

研究應(yīng)用掃描電鏡對(duì)Res干預(yù)后的病理性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行觀察，在形態(tài)學(xué)上可見典型的凋亡特征。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度Res干預(yù)后，病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖都受到一定程度的抑制，其抑制作用隨著Res濃度增加而增強(qiáng)，表明這種抑制作用有一定的劑量依賴。RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，病理性瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Res干預(yù)后，其TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA和蛋白表達(dá)降低，而Smad 7 mRNA和蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析表明，TGF-β1，Smad 2、3、4 mRNA和蛋白表達(dá)與Res干預(yù)濃度呈負(fù)相關(guān)，而Smad 7 mRNA和蛋白表達(dá)與Res干預(yù)濃度呈正相關(guān)。由此可知，Res能夠抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增值，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1，Smad 2、3、4表達(dá)并上調(diào)Smad 7表達(dá)有關(guān)，這為后續(xù)開發(fā)利用Res治療病理性瘢痕提供了理論依據(jù)。

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