響應(yīng)面法優(yōu)化黑加侖籽油中γ-亞麻酸富集工藝

焦淑清，張萍，張?jiān)平?/p>

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯154007）

響應(yīng)面法優(yōu)化黑加侖籽油中γ-亞麻酸富集工藝

焦淑清，張萍，張?jiān)平?/p>

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯154007）

采用響應(yīng)面優(yōu)化尿素包合法富集黑加侖籽油中γ-亞麻酸的最佳工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇包合溫度、尿素/混合脂肪酸配比、95%乙醇/尿素配比（m L/g）、包合時(shí)間為考察因素，進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法分析4個(gè)因素對(duì)籽油中γ-亞麻酸含量的影響。結(jié)果表明，尿素包合法富集黑加侖籽油中γ-亞麻酸的最佳工藝為包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1、95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g）、包合時(shí)間21 h，在此條件下，包合后籽油中γ-亞麻酸含量平均值為24.27%。

黑加侖籽油；γ-亞麻酸富集；尿素包合法；響應(yīng)面分析法

黑加侖（Ribes nigrum L，black.currant）是虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子屬（Ribes）一種漿果植物[1]。其果實(shí)常被制作成飲料，在黑加侖果中黑加侖籽占5%～8%[2]，在飲料等加工中產(chǎn)生了大量的黑加侖籽，其籽含油15%～20%，黑加侖籽油中γ-亞麻酸（Gamma Linlenic Acid，GLA）含量高達(dá)15%左右，是目前含有GLA最高的植物來(lái)源[3]。研究發(fā)現(xiàn)GLA對(duì)人體有多種藥理作用[4]。研究從黑加侖籽油中富集GLA從而獲得高含量的GLA是研究開(kāi)發(fā)GLA制劑的前提。尿素包合法因其諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于各種不飽和脂肪酸的富集[5]。響應(yīng)面優(yōu)化法（Response Surface Methodology，RSM）是一種優(yōu)化考察條件和加工工藝參數(shù)的有效方法[6]。利用響應(yīng)面法優(yōu)化尿素包合富集亞麻酸的研究已見(jiàn)報(bào)道[7-8]，利用此方法優(yōu)化黑加侖籽油中γ-亞麻酸的富集工藝未見(jiàn)報(bào)道。本文采用超臨界CO2萃取法與尿素包合法相結(jié)合從黑加侖籽中提取并富集GLA，采用氣相色譜法（Gas-Chromatography，GC）測(cè)定GLA的含量，研究尿素包合中各影響因素對(duì)富集效果的影響，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化尿素包合富集黑加侖籽油中GLA的工藝條件，為大規(guī)模利用黑加侖籽生產(chǎn)高含量GLA奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

超臨界CO2萃取的黑加侖籽油（自制，γ-亞麻酸含量為15.21%）。標(biāo)準(zhǔn)品γ-亞麻酸甲酯（CDDE-U-63-M-100MG）：美國(guó)NU-CHEKPREP生產(chǎn)，購(gòu)于上海安普科學(xué)儀器有限公司；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）：佳木斯市東城制氧廠；其它試劑均為分析純。氣相色譜儀（型號(hào)7890A）：美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 混合脂肪酸的制備

準(zhǔn)確稱取超臨界CO2萃取的黑加侖籽油10 g，置于三頸瓶中，加入NaOH（10%）11 mL、乙醇（95%）25mL，密閉、通入N2，在80℃下攪拌回流1.5 h.。旋轉(zhuǎn)蒸除皂化液中的乙醇。趁熱將除醇皂化液倒入一倍量的水中，用少量石油醚萃取不皂化物。在水層中加一倍量溫水稀釋，攪拌下滴加6mol/LHCl，酸化至pH= 2～3，靜置分層。水層用石油醚萃取3次，合并醚層，再與油層合并，用5%NaCl水洗至中性，用無(wú)水硫酸鈉干燥、抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，得到混合脂肪酸。

1.2.2 尿素包合富集GLA

尿素和乙醇（95%）按設(shè)定比例混合，置于三頸瓶中，在80℃下攪拌回流20min，待尿素全部溶解后滴加所制備的混合脂肪酸，密閉通入N2，在80℃下繼續(xù)攪拌回流40min，倒出冷卻后移至一定溫度下包合一定時(shí)間。將包合物迅速抽濾，用溫水洗滌濾餅，取濾液加少量稀硫酸破乳，用石油醚萃取3次，除水取有機(jī)層，用5%NaCl溶液洗至中性。加無(wú)水硫酸鈉干燥、抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸除石油醚，該濾液即為尿素非包合物，其中以GLA為主，即為包合后的黑加侖籽油。

1.2.3 分析方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密稱取γ-亞麻酸甲酯對(duì)照品2.64mg，置于5mL容量瓶中，加正辛烷溶解成2.64mg/mL的對(duì)照液，配制濃度范圍0.132mg/mL～0.792mg/mL。在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=727.73X-21.6（R2=1）。

色譜柱HP5（30m×0.25mm×0.25μm）；檢測(cè)器：FID；分流比：30∶1；載氣：高純氮?dú)?；色譜柱溫度：200℃（保持2min）210℃（保持5min）250℃（保持5min）；進(jìn)樣量：1μL。

樣品處理：精密稱取尿素包合前、后黑加侖籽油樣品各60mg，置于10mL離心管中，加入2mL正辛烷溶解，再加5mL 0.4mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻，室溫保持10min。加蒸餾水，如上層溶液混濁，加幾滴無(wú)水乙醇可迅速澄清，取上層澄清液1μL進(jìn)樣分析，與對(duì)照品溶液對(duì)照，外標(biāo)法定量。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Expert8.0.5.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用響應(yīng)面法中box-behnken設(shè)計(jì)原理，以包合溫度（℃）、尿素/混合脂肪酸（質(zhì)量比）配比、95%乙醇/尿素配比（mL/g）和包合時(shí)間（h）為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以-1、0、+1編碼，以富集產(chǎn)物中的γ-亞麻酸含量為響應(yīng)值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table1 Variables and leves in Box-Benhnken CCD

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Benhnken CCD matrix and experimental values of γ-linolenic acid content

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

按表1因素及水平表設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2中，試驗(yàn)號(hào)1～24是析因?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)號(hào)25～29是中心實(shí)驗(yàn)，29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Design Expert8.0.5.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以γ-亞麻酸含量為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各條件編碼值的二次回歸方程為：Y=+29.43+0.95X1+0.030X2-0.84X3+0.061X4-0.43X1X2+0.84X1X3-0.048X1X4+0.037X2X3-0.40X2X4-0.58X3X4-2.30X12-2.27X22-1.66X32-1.26X42

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

由表3可知，一次項(xiàng)中X1、X3的偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明包合溫度和95%乙醇/尿素的配比對(duì)黑加侖籽油的富集有極顯著影響；X1X3項(xiàng)的偏回歸系數(shù)達(dá)高度顯著水平，X3X4項(xiàng)的偏回歸系數(shù)達(dá)顯著水平；二次項(xiàng)中X12、X22、X32、X42的偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平。

2.3 交互作用分析

各因素及其交互作用對(duì)γ-亞麻酸含量的影響見(jiàn)圖1。

從圖1可以分析得出，對(duì)于包合溫度（A）、尿素/混合脂肪酸（B）、95%乙醇/尿素（C）、包合時(shí)間（D）四因素，γ-亞麻酸的含量均隨各因素值的增大先增大后減小，其中影響幅度A＞C＞B＞D。此外從各圖還可以分析得出包合溫度與95%乙醇/尿素配比、包合時(shí)間與95%乙醇/尿素兩兩間交互作用明顯，其余因素間交互作用不明顯。

圖1 各因素及其交互作用對(duì)γ-亞麻酸含量的影響Fig.1 The effect of factors and their interacion of γ-linolenic acid content

2.4 工藝條件的確定

為得出最優(yōu)提取工藝條件，將回歸模型取一階偏導(dǎo)令其等于零，解關(guān)于X1、X2、X3、X4的三元一次方程組，變換成真實(shí)值可得包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸（質(zhì)量比）配比為3.5∶1、95%乙醇/尿素（mL/g）配比為2.5∶1、包合時(shí)間為20.9 h，在此條件下GLA的理論值為24.36%。為了實(shí)際操作可行，將理論優(yōu)化包合工藝參數(shù)修正為包合溫度-20℃，尿素/混合脂肪酸配比3.5∶1，95%乙醇/尿素配比2.5∶1（mL/g），包合時(shí)間21 h。在此條件下平行進(jìn)行包合實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測(cè)得的平均γ-亞麻酸含量為24.27%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.369 4%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的可靠性。

3 結(jié)論

尿素包合富集黑加侖籽油的最佳工藝條件為包合溫度-20℃、尿素/混合脂肪酸配比為3.5：1、95%乙醇/尿素配比為2.5：1（mL/g）、包合時(shí)間21 h，在此條件下黑加侖籽油中γ-亞麻酸的含量為24.27%，比包合前（15.21%）提高了59.57%。響應(yīng)面分析法適用于對(duì)超臨界CO2萃取的黑加侖籽油進(jìn)行尿素包合富集γ-亞麻酸的參數(shù)優(yōu)化，本研究對(duì)大規(guī)模利用黑加侖籽生產(chǎn)高含量GLA具有一定的指導(dǎo)意義。

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Optimization ofγ-linolenic Acid Enrichment Technology from Blackcurrant Seeds Oil by Response Surface Methodology

JIAO Shu-qing，ZHANG Ping，ZHANG Yun-jie
（College of Pharmacy，Jiamusi University，Heilongjiang Province Key Laboratory of Biological Medicine Formulation，Jiamusi154007，Heilongjiang，China）

The present study aimed to optimize enrichment ofγ-linolenic acid from blackcurrant seeds oil using urea inclusion method and response surface methodology（RSM）combined with a 4-variable，3-level Box-Behnken central composite design（CCD）on the basis of single factor experiments.Inclusion temperature，ratio of urea-to-fatty acid，ratio of 95% ethanol-to-urea（mL/g）and inclusion time were studied.Results showed that the optimized enrichment conditions are inclusion temperature-20℃，urea-to-fatty acids ratio 3.5∶1，95% ethanol-to-urea ratio2.5∶1（mL/g）and inclusion time21 h，resulted in a average γ-linolenic acids of seeds oil yield of up to24.27%.

blackcurrant seeds oil；γ-linolenic acid enrichment；urea inclusion method；response surface methodology（RSM）

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.013

2013-08-28

本研究項(xiàng)目為佳木斯市2011年度重點(diǎn)科研課題（NO.11097）

焦淑清（1960—），女（漢），教授，本科，從事制藥工程教學(xué)和科研工作。