日本血吸蟲(chóng)組織蛋白酶B2在小鼠抗血吸蟲(chóng)再感染中的作用

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽(yáng)421001)

日本血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis)是一種呈世界性分布、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患病,傳播廣泛,危害嚴(yán)重,至今仍然是世界上亟待解決的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。人和動(dòng)物等終宿主對(duì)人體血吸蟲(chóng)無(wú)先天性免疫,但是宿主感染血吸蟲(chóng)后對(duì)再感染可產(chǎn)生不同程度的抵抗力,而對(duì)再感染具有一定免疫力被稱為伴隨免疫(concomitant immunity)。伴隨免疫是部分免疫,對(duì)血吸蟲(chóng)再感染的殺傷作用有限,并不能完全清除宿主體內(nèi)蟲(chóng)體,如果未進(jìn)行有效的治療,血吸蟲(chóng)對(duì)宿主的損害會(huì)持續(xù)存在。目前,雖然吡喹酮等有效藥物在治療血吸蟲(chóng)病方面有很好的效果,但對(duì)血吸蟲(chóng)傳播的控制仍存在許多問(wèn)題,再感染需要再治療,花費(fèi)巨大,且反復(fù)治療后血吸蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性的可能性也不容忽視。組織蛋白酶B(cathepsin B,CB)屬于半胱氨酸酶,對(duì)血吸蟲(chóng)組織蛋白酶B的研究顯示其具有下列作用：直接破壞宿主紅細(xì)胞,將宿主紅細(xì)胞中的血紅蛋白降解加以利用[1],促進(jìn)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育及雌蟲(chóng)產(chǎn)卵[2];具有侵襲力,破壞宿主的物理屏障[3],有利于蟲(chóng)體在宿主組織內(nèi)移行[4-6]。2004年本文課題組首次分離出Sjcb2(Schistosoma japonicum cathepsin B2,Sjcb2),并對(duì)其誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用進(jìn)行了初步研究,結(jié)果顯示其具有一定的抗血吸蟲(chóng)感染作用,本文進(jìn)一步研究了其在抗血吸蟲(chóng)再感染中的作用以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存;pBCsk+/Sjcb2(帶有Sjcb2 cDNA全長(zhǎng)的克隆重組質(zhì)粒)由本室制備保存(基因登錄號(hào)AY226984)。4～5周齡BALB/c雌性小鼠,由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG和抗鼠IgE抗體購(gòu)自Promega公司,EcoRI、XhoⅠ酶購(gòu)自Promega公司,質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛有限公司。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Genbank中日本血吸蟲(chóng)Sjcb2基因(序列號(hào)AY226984)全序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物P1和P2,并在2個(gè)引物的5′端分別引入限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)酶切位點(diǎn)(引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

1.2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒構(gòu)建 用Sjcb2特異性引物P1、P2對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化,用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)Sjcb2基因片段和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,分別回收和純化目的基因與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,按基因克隆方法進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化,篩選重組質(zhì)粒,用PCR和雙酶切法初步鑒定,經(jīng)基因測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。

1.2.3 質(zhì)粒的大量制備 按照質(zhì)粒大量提取試劑盒操作說(shuō)明,大量制備pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒,蛋白核酸定量?jī)x測(cè)定DNA純度及含量,用生理鹽水稀釋至1 μg/μL。

1.2.4 動(dòng)物分組與免疫 將60只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)均分為六組,建立日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型：感染組、感染攻擊組、空質(zhì)粒處理組、Sjcb2免疫組、吡喹酮處理組(PZQ處理組)、Sjcb2聯(lián)合吡喹酮處理組(Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合吡喹酮組分別在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接種pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒,空質(zhì)粒處理組接種pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒。初次尾蚴感染后第六周,對(duì)吡喹酮處理組和Sjcb2聯(lián)合吡喹酮處理組小鼠給予PZQ治療。除感染組外其它各組在第八周再次進(jìn)行尾蚴攻擊感染。分別于第8周和第14周各組處死5只小鼠,收集成蟲(chóng)、肝臟組織和血清等標(biāo)本待檢測(cè)備用。

1.2.5 檢測(cè)小鼠荷蟲(chóng)數(shù)和計(jì)算抗血吸蟲(chóng)再感染率用生理鹽水經(jīng)門靜脈灌注,收集成蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。分別計(jì)數(shù)初次感染和再次感染后血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù)。

1.2.6 抗血吸蟲(chóng)再感染率的計(jì)算 R%=[1-(n1-n2)/N]×100%?！癛”為抗血吸蟲(chóng)再感染率,“n1”為再次感染后血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù),“n2”為初次感染后血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù),“N”為感染對(duì)照組血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)數(shù)。1.2.7 蟲(chóng)卵肉芽腫直徑的測(cè)量 第14周行麻醉后處死小鼠,取小鼠肝臟左葉組織,經(jīng)10%甲醛固定,進(jìn)行石蠟包埋,制作5 μm厚的切片,HE染色,光鏡下選單個(gè)蟲(chóng)卵肉芽腫測(cè)量最大直徑,以30個(gè)單卵肉芽腫直徑的均值(±s)表示。

1.2.8 血清抗體水平的檢測(cè) 可溶性成蟲(chóng)抗原稀釋至10 μg/mL,4℃包被過(guò)夜,ELISA法檢測(cè)特異性抗體水平。

1.2.9 可溶性成蟲(chóng)抗原(SWA)的制備 采用門靜脈灌注法,從重感染45天的家兔肝門靜脈沖出血吸蟲(chóng)成蟲(chóng),用生理鹽水漂洗3次,然后加適量生理鹽水于勻漿器中冰浴勻漿1 h,反復(fù)凍融3～5次,4℃中冷浸72 h,4℃10 000 rpm離心30 min,取上清液即為成蟲(chóng)抗原。在核酸蛋白分析儀上對(duì)SWA進(jìn)行蛋白定量,蛋白含量為1.390 6 mg/mL,分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)SPSS17.0軟件進(jìn)行分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),所得數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因片段的體外擴(kuò)增

采用PCR法特異性擴(kuò)增Sjcb2基因片段,該片段分子量約為1 100 bp,與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

圖1 Sjcb2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 1：PCR產(chǎn)物;2：陽(yáng)性對(duì)照 3：DNA Markers

2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定

PCR產(chǎn)物與重組質(zhì)粒EcoRI和XhoⅠ雙酶切后的片段約1 100 bp與Sjcb2基因片段大小相符,測(cè)序證實(shí)序列正確(圖2)。

圖2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2雙酶切及PCR鑒定 1：DNA Makers;2：重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)/Sjcb2;3：pcDNA3.1(+)/Sjcb2 EcoRI和XhoI雙酶切;4：PCR產(chǎn)物

2.3 小鼠荷蟲(chóng)數(shù)和抗血吸蟲(chóng)再感染率

Sjcb2免疫組、PZQ處理組及Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,血吸蟲(chóng)尾蚴再次感染后的小鼠荷蟲(chóng)數(shù)均存在顯著差異(P＜0.01)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,抗血吸蟲(chóng)再感染率顯著性增高(P＜0.01)。在六組中Sjcb2免疫組抗血吸蟲(chóng)再感染率為最高(表1)。

表1 小鼠荷蟲(chóng)數(shù)和抗血吸蟲(chóng)再感染率

2.4 蟲(chóng)卵肉芽腫直徑的測(cè)量

研究結(jié)果表明,與感染攻擊組相比,Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組蟲(chóng)卵肉芽腫直徑都顯著性減小,而其中Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組蟲(chóng)卵肉芽腫直徑減小最明顯(表2)。

表2 蟲(chóng)卵肉芽腫直徑測(cè)量

2.5 14周小鼠肝臟病變檢測(cè)

Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與感染攻擊組相比,小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫直徑都明顯的減小,而其中Sjcb2聯(lián)合PZQ組蟲(chóng)卵肉芽腫直徑減小最明顯(圖3)。

2.6 血清抗體水平檢測(cè)

IgG亞型(IgG1,IgG2和IgG3)以及IgE檢測(cè)結(jié)果顯示,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,IgG1水平顯著性下降,IgG2水平顯著性升高(P＜0.05),見(jiàn)表3。

Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,抗血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原(soluble adult worm antigen,SWA)特異性IgE水平顯著性升高(P＜0.01)。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,抗Sjcb2特異性IgE水平顯著性增加(P＜0.01)。見(jiàn)圖4。

圖3 小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫HE染色圖(×40)

表3 血清抗體水平的檢測(cè)

圖4 血清特異性IgE水平

3 討 論

宿主感染血吸蟲(chóng)后原發(fā)感染繼續(xù)存在,而對(duì)再感染產(chǎn)生不同程度的抵抗力,即伴隨免疫(concomitant immunity),這已在國(guó)內(nèi)外的許多研究中得到證實(shí)[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中Sjcb2組、PZQ處理組及Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組與其它組比較,血吸蟲(chóng)尾蚴再次感染后的小鼠荷蟲(chóng)數(shù)均顯著性減少。PZQ處理組荷蟲(chóng)數(shù)降低是由于PZQ殺死小鼠體內(nèi)初次感染后的成蟲(chóng)所致;日本血吸蟲(chóng)組織蛋白酶B2是本研究小組首次發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的新基因,基因登陸號(hào)為AY225315。Sjcb2定位于血吸蟲(chóng)腸道,可直接破壞宿主紅細(xì)胞,將宿主紅細(xì)胞中的血紅蛋白降解加以利用,促進(jìn)蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育及雌蟲(chóng)產(chǎn)卵,同時(shí)又能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)：用Sjcb2構(gòu)建的核酸疫苗具有免疫保護(hù)作用,能在一定程度上阻斷血吸蟲(chóng)的發(fā)育及產(chǎn)卵[9]。Sjcb2免疫組荷蟲(chóng)數(shù)降低證實(shí)了Sjcb2能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用,對(duì)初次和再次感染的血吸蟲(chóng)有一定抗感染作用;Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組荷蟲(chóng)數(shù)顯著性下降,可能是聯(lián)合處理方法中PZQ殺死小鼠體內(nèi)初次感染后的成蟲(chóng),而Sjcb2具有免疫保護(hù)和抗再感染作用,兩者聯(lián)合進(jìn)一步降低小鼠體內(nèi)的荷蟲(chóng)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Sjcb2免疫組抗血吸蟲(chóng)再感染率達(dá)70.3%,Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組抗再感染率達(dá)61.9%。Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,抗血吸蟲(chóng)再感染率顯著性增高。研究表明了Sjcb2能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫,具有抗血吸蟲(chóng)再感染的能力,使得小鼠抗血吸蟲(chóng)再感染率顯著性增高。Sjcb2免疫組與Sjcb2聯(lián)合組比較,Sjcb2組抗血吸蟲(chóng)再感染率顯著性增高,Sjcb2聯(lián)合組由于經(jīng)過(guò)吡喹酮治療后,殺死了小鼠體內(nèi)首次感染的血吸蟲(chóng),導(dǎo)致小鼠伴隨免疫不能建立,小鼠抵抗血吸蟲(chóng)再感染的能力反而下降;而Sjcb2免疫組初次感染血吸蟲(chóng)后,經(jīng)再次感染可刺激機(jī)體產(chǎn)生伴隨免疫,Sjcb2抗血吸蟲(chóng)作用和伴隨免疫共同作用使得小鼠抗血吸蟲(chóng)再感染能力增強(qiáng)。

Sjcb2免疫組、PZQ處理組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它各組比較,小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫直徑顯著性減小,其中Sjcb2聯(lián)合組蟲(chóng)卵肉芽腫直徑減小具有極顯著性差異,可能與Sjcb2誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)及抗蟲(chóng)卵發(fā)育作用有關(guān),使得蟲(chóng)卵和血吸蟲(chóng)毛蚴更容易遭受宿主的免疫攻擊,而PZQ有殺蟲(chóng)作用,減少了蟲(chóng)卵的產(chǎn)生,二者聯(lián)合能顯著性減少血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵引起的免疫病理性反應(yīng)。

機(jī)體體液免疫在抗血吸蟲(chóng)感染中也發(fā)揮著重要作用,抗體可通過(guò)ADCC和調(diào)理作用產(chǎn)生抗蟲(chóng)作用,在抗血吸蟲(chóng)感染中所涉及的抗體主要有IgG[10]和IgE。Hagan[11]在研究中發(fā)現(xiàn),成蟲(chóng)抗原特異性IgE抗體在抗血吸蟲(chóng)再感染時(shí)起重要的作用。IgE不僅在血吸蟲(chóng)入侵機(jī)體后最初24 h誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞及效應(yīng)分子上起關(guān)鍵作用,而且在針對(duì)血吸蟲(chóng)獲得性免疫的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合處理組與其它組比較,抗SWA特異性IgE和抗Sjcb2特異性IgE水平顯著性升高,說(shuō)明了特異性IgE具有抗血吸蟲(chóng)再感染作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者的相關(guān)報(bào)道相符。

Dunne[13]研究表明血吸蟲(chóng)抗原特異性IgG4抗體水平升高,可使得人體更容易受到血吸蟲(chóng)的再感染,而人類的IgG4亞型和小鼠的IgG1亞型作用是一致的[14]?？寡x(chóng)再感染的程度受到IgE的保護(hù),而 IgG4(鼠IgG1)的作用卻相反,當(dāng)?shù)退降腎gE與高水平的IgG4(鼠IgG1)相差100倍以上時(shí),人體更容易受到血吸蟲(chóng)的再感染。因此,認(rèn)為可將IgG4(鼠IgG1)和IgE兩者結(jié)合起來(lái),評(píng)價(jià)它們對(duì)血吸蟲(chóng)再感染的抵抗力,根據(jù)IgG4(鼠IgG1)和IgE間的平衡情況來(lái)預(yù)測(cè)機(jī)體抗血吸蟲(chóng)再感染的能力[15]。研究發(fā)現(xiàn)Sjcb2具有降解某些IgG,降低IgG抗體水平的作用[9]。本研究結(jié)果顯示,Sjcb2免疫組和Sjcb2聯(lián)合PZQ處理組分別與其它組比較,IgG1亞型水平顯著性下降,IgE水平顯著性升高,可能與Sjcb2刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE和選擇性降解IgG的作用有關(guān)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上述兩組小鼠IgG2亞型水平顯著性升高,IgG2亞型在血吸蟲(chóng)再感染中起何種作用,是否在抗血吸蟲(chóng)再感染中與IgG1亞型起協(xié)調(diào)作用,目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,其作用機(jī)制尚不清楚。

綜上所述,血吸蟲(chóng)組織蛋白酶B2可以促進(jìn)小鼠IgE水平升高和IgG1水平降低,小鼠抗血吸蟲(chóng)再感染能力增強(qiáng),使得血吸蟲(chóng)再感染時(shí)侵襲能力下降。吡喹酮雖能殺死血吸蟲(chóng),減少小鼠體內(nèi)的荷蟲(chóng)數(shù)和蟲(chóng)卵肉芽腫,但無(wú)抗再感染的作用。Sjcb2聯(lián)合PZQ在抗血吸蟲(chóng)再感染率方面僅低于Sjcb2,而顯著性高于其它各組,且在減少小鼠體內(nèi)荷蟲(chóng)數(shù)、蟲(chóng)卵肉芽腫及肝臟免疫病理反應(yīng)等方面顯著性優(yōu)于Sjcb2和其它組,兩者聯(lián)合在抗血吸蟲(chóng)病方面具有一定的優(yōu)勢(shì)作用,這為防治血吸蟲(chóng)病提供了一個(gè)新的思路。

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