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    響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯中低聚木糖的酶法提取工藝

    2014-03-13 08:54:21葉曼曼
    中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:解液玉米芯木糖

    姚 笛 葉曼曼 李 琳 樊 蕾 孟 超 楊 健

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1,大慶 163319)

    (浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司2,杭州 310035)

    低聚木糖系由2~7個(gè)木糖分子以α-1,4糖苷鍵結(jié)合而成[1],具有很強(qiáng)的增殖腸道益生菌[2]、改善腸道微生態(tài)環(huán)境等功能[3-4],它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低,具有抗齲齒作用[5]。低聚木糖作為一種非消化性糖,理化性質(zhì)穩(wěn)定,耐酸、耐熱,是一種功能性食品配料[6-7],被認(rèn)為是目前最有前途、國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛的功能性低聚糖之一。

    低聚木糖的生產(chǎn)主要是以富含木聚糖的植物(如玉米芯、棉籽殼、麩皮等)為原料,通過(guò)木聚糖水解酶酶解而得的一種低聚糖[8-9],制備低聚木糖的原料多為木聚糖提取率較高的木質(zhì)纖維素,玉米芯中含有大約35%的半纖維素、35%的纖維素和15%的木質(zhì)素,其中半纖維素的主要組成為木聚糖,它通過(guò)降解可生產(chǎn)低聚木糖[10-11]。目前,我國(guó)對(duì)玉米芯的利用相對(duì)來(lái)說(shuō)還很少,除少量進(jìn)行初加工外,絕大部分作為農(nóng)家燃料被燒掉,既浪費(fèi)了資源又污染環(huán)境,我國(guó)對(duì)低聚木糖的研究起步較晚,與一些發(fā)達(dá)國(guó)家相比,在技術(shù)和工藝上都有一定程度的差距。近年來(lái),由于低聚木糖市場(chǎng)需求的持續(xù)增長(zhǎng),對(duì)其生產(chǎn)工藝的技術(shù)要求也不斷提高。因此,以?xún)r(jià)廉易得的玉米芯為原料,研究開(kāi)發(fā)低聚木糖產(chǎn)品具有極大的競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景[12-14]。本研究旨在開(kāi)發(fā)高附加值的低聚木糖,以玉米芯為原料,通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)酶法提取低聚木糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化,為玉米芯資源的有效利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),具有重要的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    玉米芯:大慶市郊區(qū);木聚糖酶:本實(shí)驗(yàn)室利用球毛殼霉發(fā)酵后分離純化獲得;木聚糖:sigma公司;D-木糖、3,5-二硝基水楊酸、乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 玉米芯木聚糖粗品的制備

    采用堿法提取木聚糖粗品,具體流程為:干燥的玉米芯粉→堿法浸提→上清液→過(guò)濾→粗提液→中和→沉淀→離心→水解→醇沉→離心→烘干沉淀→得木聚糖粗品。

    1.3 酶解木聚糖制備低聚木糖

    取木聚糖粗品,用蒸餾水浸泡12 h制成木聚糖濃縮液,調(diào)pH為5.7,添加木聚糖酶,搖床水浴振蕩酶解,過(guò)濾,重復(fù)3次,取其上清液進(jìn)行還原糖含量的測(cè)定。

    1.4 單因素試驗(yàn)

    以木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)影響玉米芯中低聚木糖含量的因素做單因素試驗(yàn),確定各因素適宜的范圍。

    1.5 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及其水平。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以還原糖含量為指標(biāo),選取木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),用響應(yīng)面分析(Response surface analysis,RSA)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn),以確定酶處理的最優(yōu)工藝條件。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次,取試驗(yàn)結(jié)果的平均值。其中各自變量的因素水平編碼見(jiàn)表1。

    表1 因素水平編碼表

    1.6 還原糖含量測(cè)定

    還原糖含量采用 DNS法測(cè)定(以木糖計(jì),g/L)[15]。

    1.7 酶解液組分分析

    采用高效液相色譜法分析最優(yōu)條件下玉米芯酶解液中低聚木糖的主要成分[16],色譜條件:色譜柱為Suga KS-802柱;檢測(cè)器為515示差折光檢測(cè)器;流動(dòng)相為超純水;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量5μL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)分析

    2.1.1 底物濃度對(duì)還原糖含量的影響

    由圖1可知,隨著木聚糖底物濃度的增加,酶解液中還原糖含量逐漸增加,酶解后酶解液中還原糖含量在木聚糖底物濃度為1%~5%時(shí)逐漸增加,而在3%~5%時(shí)還原糖含量增加不明顯。因此,為節(jié)省原材料,宜選用木聚糖底物濃度3%。

    圖1 底物濃度對(duì)還原糖含量的影響

    2.1.2 木聚糖酶添加量對(duì)還原糖含量的影響

    由圖2可知,隨著木聚糖酶添加量的增大,酶解液還原糖含量逐漸增加,加酶量為40 mL/g時(shí)還原糖含量最高,所加酶量以40 mL/g較好。

    圖2 加酶量對(duì)還原糖含量的影響

    2.1.3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響

    由圖3可知,隨著酶解溫度的升高,酶解液的還原糖含量先逐漸增加后有所降低,溫度過(guò)高對(duì)木聚糖酶活力有一定的影響,因此,酶解溫度為60℃時(shí)還原糖含量最高。

    圖3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響

    2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解液還原糖含量的影響

    由圖4可知,隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),酶解液的還原糖含量先增加后減少,3~5 h增加明顯,5~7 h有所降低,處理5 h時(shí)酶解液的還原糖含量最高,所以酶解時(shí)間以5 h較好。

    圖4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝參數(shù)分析

    2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

    響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝試驗(yàn)結(jié)果如表2,通過(guò)Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析,得到的方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知,底物濃度的一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平(P<0.01),加酶量的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平(P<0.05),表明這2個(gè)因素對(duì)還原糖含量的線性效應(yīng)顯著,所有二次項(xiàng)對(duì)還原糖含量的曲面效應(yīng)極顯著,交互項(xiàng)AB、AD交互效應(yīng)顯著(P<0.05),表明各影響因素對(duì)還原糖含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。表3分析結(jié)果可見(jiàn),整體模型的P值小于0.000 1,該二次方程模型達(dá)到極顯著水平,并且失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說(shuō)明該回歸方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了較好擬合,二次回歸方程為:R=3.82+0.17A+0.12B+0.08C-0.07D-0.18AB+0.02AC-0.26AD-0.06BC-0.04BD-(5.00E+003)CD-0.95A2-0.43B2-0.25C2-0.41D2

    表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

    表3 回歸模型方差分析

    2.2.2 響應(yīng)面以及等高線分析結(jié)果

    響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因子交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀。圖5、圖6是對(duì)響應(yīng)值還原糖含量影響較大的兩因素交互作用的響應(yīng)面,其他因素交互作用不顯著。

    圖5 底物濃度和加酶量對(duì)還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

    由圖5可知,底物濃度在(3%~4%)范圍內(nèi),木聚糖酶添加量在(40~50 mL/g)范圍內(nèi)時(shí),兩者存在著顯著的增效作用,還原糖含量隨著底物濃度和木聚糖酶添加量的增加而增加;而當(dāng)?shù)孜餄舛攘吭冢?%~3%)范圍內(nèi),木聚糖酶添加量在(30~40 h)范圍內(nèi)時(shí),還原糖含量隨著兩個(gè)因素的增加而減少。由圖6可知,底物濃度在(3%~4%)范圍內(nèi),酶解時(shí)間在(5~6 h)范圍內(nèi)時(shí),兩者存在著顯著的增效作用,還原糖含量隨著底物濃度和酶解時(shí)間的增加而升高;而當(dāng)?shù)孜餄舛仍冢?%~3%)區(qū)間,酶解時(shí)間在(4~5 h)還原糖含量隨著兩個(gè)因素的增加開(kāi)始降低。

    圖6 底物濃度和酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

    為了確定最佳點(diǎn)的值,對(duì)試驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行分析,以得到高還原糖低聚木糖的最佳制備工藝條件,經(jīng)分析得出最佳制備條件為:底物濃度為3%,加酶量為41 mL/g(底物),51℃時(shí)酶解4.88 h所得的低聚木糖含量最高,3.88 mg/mL。為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性,采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行玉米芯中低聚木糖的提取,同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利,最佳條件修正底物濃度為3%,加酶量為40 mL/g(底物),50℃時(shí)酶解5 h所得的低聚木糖含量為3.86 mg/mL。與預(yù)測(cè)值比較可知,本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

    2.3 優(yōu)化條件下酶解液的組分分析

    采用HPLC對(duì)玉米芯酶解液中低聚木糖組分進(jìn)行分析,低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜如圖7所示,從圖7可以看出,1號(hào)峰為木糖,出峰時(shí)間11.426 min,2號(hào)為木二糖(10.324 min),3號(hào)為木三糖(9.875 min),4號(hào)為木四糖(9.216 min),5號(hào)為木五糖(8.571 min)。酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜如圖8,由積分面積可知低聚木糖(木二~木五)的相對(duì)含量達(dá)68.1%,說(shuō)明此水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

    圖7 低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

    圖8 酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜

    3 結(jié)論

    采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),經(jīng)響應(yīng)面分析結(jié)合實(shí)際值確定玉米芯酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為底物濃度3%,加酶量為40 mL/g(底物),50℃時(shí)酶解5 h所得的酶解液中還原糖含量為3.86 mg/mL。能夠使玉米芯中的木聚糖充分水解得到低聚木糖,并通過(guò)HPLC進(jìn)行水解產(chǎn)物的分析,證明水解產(chǎn)物中含有較高的木二糖、木三糖、木四糖及木五糖等低聚木糖組分,低聚木糖(木二~木五)的相對(duì)含量達(dá)68.1%,因此說(shuō)明優(yōu)化的水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

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