進口玉米酒糟粕中15種真菌毒素的檢測和風險分析

楊振宇 俞天樂 周 瑤 張浩平 馮 晶

（上海出入境檢驗檢疫局，上海 200131）

含可溶物干玉米酒糟（Distillers Dried Grainswith Solubles，以下簡稱DDGS）主要指現(xiàn)代化燃料酒精工廠，干法生產(chǎn)燃料酒精過程中，用玉米子實與精選酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精和二氧化碳后，剩余的發(fā)酵殘留物通過低溫干燥形成的一種共生產(chǎn)品［1］，可作為牲畜和家禽日糧的組分［2］。然而，由于真菌霉素污染等問題，DDGS的使用一直受到限制。玉米中可能存在多種真菌毒素，包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、伏馬菌素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮（ZON）等。這些毒素大多在收獲之前生成于玉米中。由玉米制成的DDGS水分含量高，霉菌容易生長，也會造成真菌霉素含量增高［3-4］。此外，DDGS生產(chǎn)過程不但不會去除真菌毒素，而且會濃縮富集，導致DDGS中真菌霉素的含量為原料玉米中的3倍［5］。

飼喂含有真菌毒素的飼料會導致家畜免疫力低下、病患率升高，生產(chǎn)性能下降［6］。所以世界各國，包括中國都制定了飼料中一部分真菌毒素的限量［7-10］。國標中沒有針對DDGS的限量要求，目前僅有對玉米的限量：黃曲霉毒素B1≤50μg／kg、赭曲霉毒素A≤100μg／kg和玉米赤霉烯酮≤500μg／kg。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2只有配合飼料的限量（最嚴格為 1 mg／kg）。

真菌毒素的檢測方法很多，主要有薄層色譜法［10-14］、酶聯(lián)免疫法［13-17］、液相色譜法［18-21］等。國標規(guī)定的部分真菌毒素的檢測方法也都采用了這3種方法。但是，這些方法存在著一定缺陷。如薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法只是半定量方法，液相色譜法定量較為準確，但定性能力不足，而且這些方法都只能檢測某一種或者某一類最多4種真菌毒素。液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSMS）技術大大增強了定性定量能力，在真菌毒素分析方面成為目前最先進的分析技術［22-24］。本試驗以液相串聯(lián)質(zhì)譜技術同時檢測DDGS中15種真菌毒素。該方法只需1次凈化，過程簡單快速，定性定量準確。使用該方法對入境的DDGS樣品進行檢測，通過對結果分析并進行分布擬合，首次提出了入境DDGS中真菌毒素的風險評價結論。

1 材料與方法

1.1 試劑

水：密理博純水機生產(chǎn)的一級水；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨（色譜純）：國藥集團；真菌毒素標準品黃曲霉毒素 B1（AFT B1）、B2（AFT B2）、G1（AFT G1）、G2（AFT G2）、雜色曲霉毒素（ST）、玉米赤霉烯酮（ZON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-Ac-DON）、鐮刀菌烯酮（FX）、二醋酸熏草鐮刀菌烯醇（DAS）、新茄病鐮刀菌烯醇（NEO）、T-2毒素（T-2）、毒素（HT-2）：奧地利 biopure公司，用乙腈配制成10 mg／L的標準溶液。

1.2 儀器和設備

TSQQuantum Ultra液相串聯(lián)質(zhì)譜儀：配ACCELA液相色譜，Thermo fisher公司；Allegla X-22R高速離心機：Beckman Coulter公司；PT2100均質(zhì)儀：Poly TRO公司；QGC-12T氮吹儀：泉島公司；890／H超聲儀：Elma公司；Myco 226多功能凈化柱：ROMER公司；0.22μm有機相針式濾膜：CNW公司。

1.3 前處理試驗方法

準確稱取DDGS樣品5 g左右到50 mL塑料離心管中，加入25 mL乙腈水溶液（86∶14），用均質(zhì)儀在20 000 r／min下均質(zhì)1 min，然后超聲提取30 min，在4 000 r／min轉速下離心5 min，收集上清液。加25 mL乙腈∶水（1∶1）到殘存固體中，在渦旋振蕩器上振蕩使固體均勻分散，然后超聲30 min，在4 000 r／min轉速下離心5 min。合并2次上清液至50 mL離心管中，加入乙腈至50 mL?；靹?。

吸取10 mL上清液過Myco 226多功能凈化柱，準確吸取過柱的凈化液5 mL，在60℃水浴氮吹至近干。然后用1 mL甲醇醋酸銨水溶液（甲醇：10 mmol醋酸銨水溶液為1∶1）溶解，過膜至進樣瓶中，用LCMSMS測量，外標法定量，結果需經(jīng)回收率校正。

1.4 儀器試驗方法

儀器檢測分2次。1次為正離子模式，檢測AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2、ST、DAS、NEO、T-2、HT-2；1次為負離子模式，檢測 ZON、DON、NIV、3-AcDON、15-AcDON、FX。色譜柱采用 Thermo公司Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm×1.9μm）PFP色譜柱；柱溫：35℃；進樣量：10μL；流動相甲醇水梯度洗脫。離子設置見表1。AFT B1、B2、G1、G2的標準曲線范圍均為0～4μg／L；DAS的標準曲線范圍為0～10μg／L；T-2、HT-2、ST、NEO的標準曲線范圍為0～20μg／L；ZON的標準曲線范圍均為0～100 μg／L；DON、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON的標準曲線范圍為0～1 000μg／L。

表1 15種真菌毒素的性質(zhì)

2 結果與分析

2.1 方法指標及驗證

由于不同的真菌毒素在質(zhì)譜上形成離子的情況不同，而且離子化試劑、流動相分離效果也不同。本研究將真菌毒素分成正負2類來檢測，這2類毒素在質(zhì)譜上的檢測參數(shù)都不完全相同，分組詳見1.4節(jié)。15種真菌毒素色譜圖見圖1、圖2。

圖1 正離子模式的色譜圖

圖2 負離子模式的色譜圖

本研究對方法進行了驗證。15種真菌毒素標準曲線的相關系數(shù)都在0.99以上，線性良好。

根據(jù)精密度、色譜圖干擾情況等方面的綜合考慮，15種真菌毒素的定量檢出限（LOQ）估計值見表2。

表2 15種真菌毒素的定量檢出限／μg／kg

本研究通過對真菌毒素含量較低的DDGS樣品進行加入已知濃度標準品以驗證方法的回收率和精密度（n＝6）結果見表3～表6。

表3 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的添加回收和精密度結果／%

表4 T-2、HT-2、ZON和ST的添加回收和精密度結果／%

表5 NEO、DAS和FX的添加回收和精密度結果／%

表6 DON、NIV、3-AcDON和15-AcDON的添加回收和精密度結果／%

由表3～表6可以看到，不同真菌毒素的回收率并不相同，但是相對標準偏差均小于15%。造成部分真菌毒素回收率較低的原因可能是過柱造成的回收率損失；液質(zhì)的基質(zhì)抑制效應。相對偏差較小說明方法具有較好的重現(xiàn)性，所以可以采取回收率校正的方式定量。本研究采用的15個真菌毒素的數(shù)據(jù)均是對實際檢測值用平均回收率校正后的結果。

本研究還對2種有證標準物質(zhì)（CRM）進行了檢測。每個樣品檢測3次，檢測結果見表7。

表7 有證標準物質(zhì)的檢測結果／μg／kg

從表7可以看到，結果均在有證標準物質(zhì)的標稱值之內(nèi)，說明本方法準確度可靠。

2.2 檢測結果

本研究抽取了從上海進口的67件DDGS樣品，按照本研究建立的檢測方法進行檢測。AFTB2、AFT G1、AFTG2、DAS、NEO、FX、NIV、3-AcDON、15-AcDON結果均小于檢出限，而AFTB1有16個樣品有檢出，均小于5μg／kg，離限量50μg／kg比較遠；ST有17個樣品有檢出，均小于4μg／kg，這些數(shù)據(jù)結果不再討論。所有樣品的DON、ZON、T-2、HT-2都有檢出，統(tǒng)計結果見表8。由于T-2、HT-2屬于一類毒素，同時統(tǒng)計了T-2類總量。

2.3 T-2、HT-2毒素的含量結果分析

表8的數(shù)據(jù)中，T-2類毒素的總量是由T-2和HT-2的含量加和得到?？梢钥闯觯琓-2、HT-2大概成線性關系，擬合直線圖見圖3。其線性方程為Y（HT-2）＝0.966＋1.652X（T2），相關系數(shù)為0.980。

表8 T-2、HT-2、ST、DON、ZON含量統(tǒng)計結果

圖3 T-2和HT-2的線性擬合圖

可以看到，T-2、HT-2含量之間的相關性非常好，兩者的比例大約是 8（HT-2）：5（T-2）。其中HT-2占到了62%。

另外，本研究還使用＠Risk ver 5.7軟件模擬了T-2類總量的分布，得到的圖形和擬合曲線見圖4。

圖4 T-2類總量的擬合分布

從圖4可以看到，DDGS中T-2類總量可以用Person 5分布來模擬。通過模擬的分布曲線，也可以得到目前上?？诎哆M口的DDGS的T-2和HT-2有95%可能性不會超過75μg／kg；99%可能性不會超過185μg／kg。

2.4 DON、ZON毒素的含量結果分析

表8的數(shù)據(jù)說明了DON、ZON均有檢出。其中DON和ZON也有一定的正相關關系。具體擬合直線見圖 5。其線性方程為 Y（DON）＝-16.34＋0.43X（ZON）相關系數(shù)為0.843。說明存在著高含量的DON，也存在著高含量的ZON，反之亦然。

圖5 DON和ZON的擬合直線

除了以上T-2類毒素以及DON和ZON之間存在著相關性以外，其他毒素之間的關系均未發(fā)現(xiàn)有相關性。由于DON主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生，二者也是產(chǎn)生ZON的菌種，所以二者同時出現(xiàn)的概率很大，本研究所得到二者的結果有一定的相關性，也是很自然的。

另外，類似于T-2類總量的處理，使用＠Risk ver 5.7軟件模擬了ZON和DON的分布，得到的圖形和擬合曲線分別見圖6和圖7。從圖6～圖7可以看到，DDGS中ZON和DON含量均可以用Invgauss分布來模擬。通過模擬的分布曲線進行概率計算，可以得到目前上?？诎哆M口的DDGS的ZON有95%可能性不會超過183μg／kg；99%可能性不會超過241μg／kg。DON含量有95%可能性不會超過406 μg／kg；99%可能性不會超過535μg／kg。

圖6 ZON的擬合分布

圖7 DON的擬合分布

從數(shù)據(jù)分析可以看到，DDGS中含有一定量的DON和ZON，參照飼料衛(wèi)生標準，可以看到這2種真菌毒素99%的概率不會超過限量的一半。而T-2和HT-2的總量也不會超過配合飼料限量（1 mg／kg）的20%。

3 結論

本研究建立了液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測玉米酒糟粕中多種真菌毒素的檢測方法，采用乙腈水溶液提取，用Myco-226柱凈化，LC-MS-MS檢測。檢測的真菌毒素包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、雜色曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、鐮刀菌烯酮、二醋酸熏草鐮刀菌烯醇、新茄病鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等15種。方法均經(jīng)過優(yōu)化和驗證，定性定量準確，滿足進口玉米酒糟粕的檢測要求。

根據(jù)對67個進口美國玉米酒糟粕樣品的檢測結果，發(fā)現(xiàn)這些樣品中玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素等真菌毒素均有檢出。本研究對這些數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，可以得到以下結論：T-2和HT-2含量相關系數(shù)達到0.980；DON和ZON含量相關系數(shù)達到0.843。另外，DON、ZON、T-2類超出限量的可能性不大。而這些毒素的協(xié)同作用造成的危害目前仍然是空白?？傮w而言，DDGS中存在著一定水平的真菌毒素含量，在作為飼料配料時要了解其含量水平，選用毒素含量低的DDGS，優(yōu)化配方，保證飼料的安全。

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