生防菌XM-10抑菌活性測(cè)試及鑒定

張雪輝，唐 蕊，徐立實(shí)，馬 錫

(邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北 邢臺(tái) 054001)

生物防治具有安全、無(wú)殘留、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，隨著人們對(duì)蔬菜的數(shù)量和質(zhì)量需求的不斷提高，世界各國(guó)對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)的日益重視，植物病害的生物防治已成為重要的防治手段，并廣泛運(yùn)用于生產(chǎn)，取得了顯著效果。其中利用植物病原菌的拮抗菌即生防菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治研究是當(dāng)前的一大熱點(diǎn)，也將成為控制植物病害所的最佳選擇之一。目前，研究發(fā)現(xiàn)的生防菌的種類(lèi)包括真菌、細(xì)菌和放線菌等，并且一些抑菌效果顯著的生防菌已經(jīng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如德國(guó)開(kāi)發(fā)的商品制劑Contans WG可以用于防治萵苣菌核病，美國(guó)研制成功的Soil Gard，用于防治猝倒病和根腐，意大利研制的Biofox C專(zhuān)用于防治鐮刀菌屬病害[1]；芬蘭的Kemira用灰綠鏈霉菌研制的放線菌活體制劑Mycostop通過(guò)在植物的根部定殖、生長(zhǎng)、繁殖來(lái)防治一些常見(jiàn)的土傳病害,且對(duì)植物沒(méi)有任何毒性[2]。但多數(shù)研究處于試驗(yàn)研發(fā)階段。王遠(yuǎn)山等發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌GH6菌株對(duì)煙草疫霉具有較好的拮抗作用[3]。張璐等利用從黃瓜根際土壤篩選的細(xì)菌DS-1、放線菌SG-126和細(xì)菌Q-2防治黃瓜枯萎病的效果分別為51.43%、42.86%和 37.50%[4]。燕嗣皇等[5]、周淑香等[6]發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)人參銹腐病菌、西洋參立枯病菌及黃芪根腐病菌等藥用植物病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用。本試驗(yàn)從土壤中分離出一菌株XM-10，并測(cè)試了其對(duì)多種植物病原菌的拮抗作用，發(fā)現(xiàn)其抑菌活性較強(qiáng)，具有較為廣泛的抑菌譜，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定，為該菌株開(kāi)發(fā)成環(huán)境友好型生物制劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

生防菌XM-10、黃瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋(píng)果輪紋病菌、大豆菌核病菌、棉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫病病菌等(邢臺(tái)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaC1 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂 17 g，水 1000 mL,pH7.2～7.4。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17 g，水 1000 mL。

1.3 主要儀器

SPX-250B-Z型生化恒溫培養(yǎng)箱、ZWY-2102C雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱、Gene Pro基因擴(kuò)增儀、凝膠成像儀、ZHJH-C1115B型無(wú)菌操作臺(tái)、TGL-20M臺(tái)式冷凍離心機(jī)等。

1.4 生防菌XM-10抑菌活性測(cè)定

以黃瓜枯萎、小麥赤霉等9種病原菌為靶標(biāo)菌，活化培養(yǎng)，用打孔器打取直徑為1.0cm的菌盤(pán)，置于PDA平板的中央,在平板內(nèi)一側(cè)靠近邊緣的兩個(gè)點(diǎn),接入放線菌XM-10,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于25℃培養(yǎng)4 d，測(cè)量抑菌帶，計(jì)算抑菌率[7]。

1.5 生防菌XM-10的鑒定

1.5.1 個(gè)體形態(tài)顯微觀察

在高氏一號(hào)培養(yǎng)平板上，接入生防菌XM-10菌體，在培養(yǎng)基上嵌入蓋玻片，待生防菌XM-10長(zhǎng)到蓋玻片上后，取下蓋玻片，進(jìn)行菌體形態(tài)顯微觀察。

1.5.2 菌落形態(tài)特征觀察

將生防菌XM-10接到高氏一號(hào)培養(yǎng)平板和PDA平板上，觀察其菌落特征。

1.5.3 16S rRNA序列分析

基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)[8-9]所述方法進(jìn)行。即將生防菌XM-10轉(zhuǎn)接到高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,取40 mL,1 0000 r/min,離心5 min,收集菌體，用生理鹽水洗滌2遍,取1 mL于1.5 mL離心管中充分懸浮菌體，每管加入300 mL TE溶液,再加入10 mg/mL的溶菌酶溶液10μL和20 mg/mL的蛋白酶K溶液6μL,充分搖勻,于37℃水浴2 h。每管加入10%SDS溶液20μL和0.5 mmol/L的EDTA溶液20μL,55℃水浴過(guò)夜。加等體積的Tris飽和酚溶液,充分搖勻，1 0000 r/min離心8 min,取上清轉(zhuǎn)至離心管中。向各管中添加等體積的24∶1的氯仿/異戊醇,充分搖勻,1 0000 r/min離心8 min,取上清轉(zhuǎn)至離心管中。加等體積異丙醇,-20℃沉淀30 min,8000 r/min離心5 min,棄上清，保留沉淀。加70%乙醇洗滌2次,每次用8000 r/min離心5 min,棄上清，保留白色沉淀。將各離心管倒置于無(wú)菌濾紙上,充分干燥后,加 30μL TE 溶液,4℃過(guò)夜,取 5μL，在 80 V電壓下進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察比較，采集圖像。

將經(jīng)酶法提取得到的生防菌XM-10總DNA進(jìn)行16S rRNA的擴(kuò)增[10]。PCR擴(kuò)增正向引物為PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物 PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR擴(kuò)增條件為:95℃ 5 min；95℃ 1 min,54℃ 1 min,72℃ 3 min,35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化。

PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。再利用blast在線分析比對(duì)服務(wù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行相關(guān)有效種的相似性搜索,并結(jié)合形態(tài)特征，確定菌株的屬種。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性測(cè)定

生防菌XM-10對(duì)小麥赤霉等9種植物病原菌的抑制效果(表1)，對(duì)所測(cè)定的9種植物病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，抑菌率在47.8%～87.6%之間，其中對(duì)小麥赤霉病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制率分別達(dá)到了87.6%和83.7%，抑菌帶在4.9～6.9 mm之間，其中對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌帶最寬，達(dá)6.9 mm。表明其抑菌譜較廣。

表1 生防菌XM-10的抑菌活性

2.2 生防菌XM-10的鑒定

2.2.1 個(gè)體形態(tài)顯微觀察

對(duì)生防菌XM-10個(gè)體形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，總結(jié)特征如下：呈現(xiàn)大量細(xì)小的菌絲(圖1-1)，無(wú)隔、有分支。孢子絲長(zhǎng)而直，少數(shù)頂端圈卷。孢子球形，表面光滑(圖 1-2)。

2.2.2 菌落形態(tài)特征觀察

在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上XM-10菌落特征表現(xiàn)為灰色干燥粉末、圓形、菌落隆起，基生菌絲微黃色，不易挑取、與培養(yǎng)基較緊密的結(jié)合在一起，菌落也沒(méi)有霉菌菌落那么大和疏松。在PDA培養(yǎng)基上，呈鼠灰色至灰褐色，邊緣白色(圖1-3)。

圖1 生防菌XM-10個(gè)體形態(tài)及菌落特征

2.2.3 生防菌XM-10的16S rRNA序列分析

生防菌XM-10基因組DNA在凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像見(jiàn)圖2左。與marker相比，可以得知生防菌XM-10基因組DNA大于2000 bp。16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像見(jiàn)圖2右。從圖中可以分析得知，PCR產(chǎn)物分子量大約在1500 bp左右。經(jīng)過(guò)16S rRNA基因測(cè)序，得知生防菌XM-10的16S rRNA基因序列的有效片段長(zhǎng)度為1461 bp。經(jīng)Blast比對(duì)，與生防菌XM-10相似性最高有效種為黃灰鏈霉菌(Streptomyces flavogriseus ATCC 33331,相似性為98%)，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌 (S.venezuelae ATCC 10712,相似性為98%)，灰色鏈霉菌 (S.griseus subsp.griseus NBRC 13350,相似性為98%),海洋鏈霉菌(S.sp.Sirex AA-E,相似性為98%)。根據(jù)上述分析結(jié)果，結(jié)合對(duì)生防菌XM-10菌落外部特征和菌體形態(tài)的觀察，可以初步判定生防菌XM-10為黃灰鏈霉菌。

圖2 基因組DNA和PCR產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

生物防治是環(huán)境友好的防治方法，可以減輕化學(xué)農(nóng)藥污染，符合高效環(huán)保的理念，有利于可持續(xù)發(fā)展，并有修復(fù)土壤生物多樣性的作用，極具開(kāi)發(fā)潛力，成為當(dāng)今研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[11]。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，也是人口大國(guó)，不斷提高農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量勢(shì)在必行。篩選拮抗能力強(qiáng)、抑菌譜廣、抗逆性強(qiáng)以及在植物根際和土壤定殖能力強(qiáng)的植物病原菌的拮抗菌，是未來(lái)研發(fā)生防制劑的主要方向[12]。本試驗(yàn)從土壤中分離出的菌株XM-10，對(duì)多種植物病原菌有較強(qiáng)的拮抗活性，具有較為廣泛的抑菌譜，因此該拮抗菌具有良好的應(yīng)用潛力和前景。16S rRNA基因序列具有保守性、存在的普遍性和基因序列的穩(wěn)定性，使得16S rRNA基因序列分析的重現(xiàn)性極高[13]。同時(shí)16S rRNA基因序列具有功能和進(jìn)化的同源性，分子大小適中，并攜有充分的生物信息，16S rRNA序列分析在現(xiàn)代微生物分類(lèi)鑒定上發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。本研究通過(guò)16S rRNA序列分析，結(jié)合個(gè)體形態(tài)特征和菌落特征觀察，將生防菌XM-10初步判定為黃灰鏈霉菌。

應(yīng)用生防菌的活體制劑，會(huì)避免大量單一使用抗生素造成的破壞自然界微生物的平衡、造成自然選擇壓力等弊端，應(yīng)用前景廣闊。本研究中生防菌XM-10是在抑菌試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其具有較為廣泛的抑菌譜，有希望開(kāi)發(fā)成廣譜的活體制劑。但生防菌在生產(chǎn)應(yīng)用上存在一些問(wèn)題，如在田間的定殖能力，生防菌的抗藥能力，菌種穩(wěn)定性問(wèn)題等。因此，要充分發(fā)揮該拮抗菌的生防潛能，在理論和實(shí)踐上還需要進(jìn)行大量的研究工作，如生防菌XM-10發(fā)酵條件優(yōu)化、活性物質(zhì)分離純化、抑菌機(jī)理研究及在田間施用后，在植物根際或土壤中的定殖能力，抗各種化學(xué)藥劑的能力及其遺傳穩(wěn)定性等。

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