翡翠貽貝多糖對宮頸癌細胞凋亡及miRNA-34a表達的影響

賴銀璇，何冬梅，楊麗梅，劉新光，李江濱

（1. 廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 湛江 524023；2. 惠州市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 惠州 516001；3. 廣東醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，廣東 東莞 523808）

·基礎研究·

翡翠貽貝多糖對宮頸癌細胞凋亡及miRNA-34a表達的影響

賴銀璇1，何冬梅2，楊麗梅3，劉新光3，李江濱3

（1. 廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 湛江 524023；2. 惠州市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 惠州 516001；3. 廣東醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，廣東 東莞 523808）

目的 觀察翡翠貽貝多糖對體外培養(yǎng)宮頸癌細胞凋亡及miRNA-34a表達的影響。方法100 mg/L翡翠貽貝多糖處理宮頸癌細胞48 h后，流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況，實時定量PCR檢測宮頸癌細胞中miRNA-34a表達。結(jié)果 與對照組相比，翡翠貽貝多糖處理后的宮頸癌細胞凋亡率顯著增加（P＜0.001），同時宮頸癌細胞中miRNA-34a表達增加（P＜0.01）。 結(jié)論 翡翠貽貝多糖通過上調(diào)miRNA-34a表達誘導宮頸癌細胞凋亡。

翡翠貽貝；多糖；宮頸癌；細胞凋亡；miRNA

現(xiàn)代藥理學研究表明，從貽貝中提取到的多種活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[1]。翡翠貽貝多糖（perna viridis polysaccharides，PVPS）是以翡翠貽貝肉為原料，制備得到的多糖成分。本課題組在之前的研究中觀察到翡翠貽貝多糖有良好的直接抑制宮頸癌腫瘤細胞生長的作用，同時還能顯著改善荷瘤模型小鼠的免疫功能，提高T淋巴細胞增殖能力和IL-2分泌[2-4]。微小RNA （microRNA，miRNA）是一類長度約為21個核苷酸、進化上高度保守的非編碼單鏈RNA分子。miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，能對基因活動的各個層面進行調(diào)節(jié)，近年來，隨著對miRNA研究的興起，發(fā)現(xiàn)miRNA在細胞凋亡的調(diào)控中起著至關重要的作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達，參與癌細胞重要的細胞生物程序的調(diào)控[5]。miRNA-34a表達的下調(diào)或缺失與腫瘤的發(fā)生和細胞增殖之間存在著聯(lián)系[6-7]，表明miRNA-34a對抑制細胞增殖，激活細胞凋亡途徑有重要意義。為進一步探討翡翠貽貝多糖是否通過調(diào)控miRNA-34a表達而誘導宮頸癌腫瘤細胞凋亡，本研究以翡翠貽貝多糖作用于人宮頸癌Hela細胞株，檢測其對宮頸癌細胞凋亡及miRNA-34a表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人宮頸癌Hela細胞株，由廣東醫(yī)學院衰老研究所提供。

1.1.2 試劑

小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM（GIBCO公司），胰酶細胞消化液（Beyotime公司），細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），miRNA-34a引物（上海吉瑪試劑公司），定量PCR法miRNA檢測試劑盒（Exiqon公司），翡翠貽貝多糖（PVPS）由廣東醫(yī)學院檢驗醫(yī)學研究所提供，多糖含量83.5%，實驗時用無血清培養(yǎng)液配制成相應濃度藥液，過濾除菌后備用。

1.1.3 器材

FACSCanto2流式細胞儀（BD公司）；7500型熒光定量PCR儀（ABI公司）；Synergy2多功能酶標儀（Biotek）；XD-101倒置顯微鏡（OLYMPUS）；CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 給藥

取對數(shù)生長期的宮頸癌細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，重懸后，按每孔5 ×104個細胞加入12孔板，每孔1 mL細胞懸液，設對照組和實驗組，每組4孔。細胞貼壁后，實驗組加入50 μL翡翠貽貝多糖藥液，使翡翠貽貝多糖終濃度為100 mg/L，對照組加入50 μL細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，檢測細胞凋亡及miRNA-34a表達。

1.2.3 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況

按細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 實時定量PCR檢測miRNA-34a表達

采用實時定量PCR法，按miRNA檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0軟件進行兩組間比較t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 對細胞凋亡的影響

給藥作用48 h后，翡翠貽貝多糖實驗組宮頸癌細胞凋亡率為40.1%±6.6%，對照組宮頸癌細胞凋亡率為7.5%±2.0%，翡翠貽貝多糖實驗組宮頸癌細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=22.92，P =0.000）。

2.2 對miRNA-34a表達的影響

給藥作用48 h后，對照組宮頸癌細胞miRNA-34a表達相對值為1.11±0.14，翡翠貽貝多糖實驗組宮頸癌細胞miRNA-34a表達相對值為2.45±0.55，翡翠貽貝多糖實驗組miRNA-34a表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（t =6.93，P =0.006）。

3 討 論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，中國每年宮頸癌新發(fā)病例超過13萬，約3萬婦女死于宮頸癌，嚴重影響婦女的生活健康，研究宮頸癌的藥理機制對宮頸癌的診療具有重要的意義。miRNA-34a的非正常表達出現(xiàn)在不同類型的腫瘤中。Soichiro等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a可通過靶向c-Myc癌基因抑制腎癌細胞的惡變。Tivnan等[7]對神經(jīng)細胞瘤的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a基因經(jīng)常缺失，同時人為提高miRNA-34a的表達能夠抑制腫瘤細胞增殖，并激活細胞凋亡途徑，表明miRNA-34a對抑制細胞增殖、激活細胞凋亡途徑有重要意義。課題組前期工作表明，翡翠貽貝多糖能抑制腫瘤細胞生長[2-3]，但其分子機制尚不清楚。為了探討翡翠貽貝多糖是否通過調(diào)控miRNA表達而誘導腫瘤細胞凋亡，本課題組在前期實驗中觀察了miRNA-34a差異表達后對宮頸癌細胞增殖的影響，結(jié)果表明，miRNA-34a過表達抑制宮頸癌細胞增殖，miRNA-34a低表達促進宮頸癌細胞增殖，miRNA-34a是一種在宮頸癌細胞生長中起調(diào)控作用的miRNA，其調(diào)控宮頸癌細胞增殖的效果為負調(diào)控，類似于抑癌基因。因此調(diào)控miRNA-34a表達很可能是調(diào)控宮頸癌細胞增殖與凋亡的新的靶點。本研究在此基礎上探討了翡翠貽貝多糖是否通過調(diào)控miRNA-34a表達而誘導宮頸癌細胞凋亡，結(jié)果表明實驗組宮頸癌細胞凋亡和miRNA-34a表達同時升高，提示miRNA-34a很可能是翡翠貽貝多糖調(diào)控宮頸癌細胞凋亡的藥理靶點之一，翡翠貽貝多糖通過上調(diào)miRNA-34a表達，從而誘導了宮頸癌細胞的凋亡。

[1] 李江濱, 黃迪南. 貽貝的藥用價值研究進展[J]. 水產(chǎn)科學, 2004, 23(11): 43-44.

[2] 許子茂, 李江濱, 侯敢. 翡翠貽貝多糖的制備及體外對Hela腫瘤細胞生長的抑制作用[J]. 中國現(xiàn)代藥物應用, 2010, 4(7): 1-2.

[3] 李江濱, 何冬梅, 賴銀璇, 等. 翡翠貽貝多糖抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖的實驗研究[J]. 中國現(xiàn)代藥物應用, 2011, 5(1): 17-18.

[4] 許子茂, 李江濱, 侯敢. 翡翠貽貝多糖對荷瘤小鼠的抗腫瘤和免疫功能調(diào)節(jié)作用[J]. 中國現(xiàn)代藥物應用, 2010, 4(9): 15-16.

[5] 劉禹, 姜曉峰. MicroRNA與腫瘤的研究進展[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志, 2010, 31(5): 465-467.

[6] SOICHIRO Y, SHARANJOT S, SHAHANA M, et al. MicroRNA-34a suppresses malignant transformation by targeting c-Myc transcriptional complexes in human renal cell carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2012, 33(2): 294-300.

[7] TIVNAN A, TRACEY L, BUCKLEY P G, et al. MicroRNA-34a is a potent tumor suppressor molecule in vivo in neuroblastoma[J]. BMC Cancer, 2011, 11: 33.

（責任編輯：劉俊華）

Effects of perna viridis polysaccharides on apoptosis of cervical cancer cell and expression of miRNA-34a

LAI Yinxuan1, HE Dongmei2, YANG Limei3, LIU Xinguang3, LI Jiangbin3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, Chinese Medicine Hospital of Huizhou City, Huizhou 516001, China; 3. School of Laboratory Medicine, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China)

Objective To investigate the effects of perna viridis polysaccharides (PVPS) on apoptosis of cervical cancer cell and expression of miRNA-34a. Methods Cervical cancer cells were treated with PVPS (100 mg/L) for 48 hours, then flow cytometry was used to analyse apoptosis and real-time quantitative PCR to detect expression of miRNA-34a. Results Compared with control group, PVPS can significantly rise the apoptosis rate (P＜0.001) and expression of miRNA-34a (P＜0.01) in cervical cancer cell. Conclusion PVPS can induce apoptosis of cervical cancer cell by elevate expression of miRNA-34a.

perna viridis; polysaccharides; cervical cancer; apoptosis; miRNA

R966

A

1674-490X(2014)02-0001-03

2013-12-20

國家自然科學基金（81170327）；廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20121113）；湛江市科技攻關項目（2012C3101025）；廣東省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（1057112048）

賴銀璇（1978—），女，廣東普寧人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科疾病防治研究。

李江濱（1975—），男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，碩士，主要從事中藥藥理與分子醫(yī)學研究。E-mail: 86971828@qq.com