豬組織中氟尼辛殘留量的HPLC測定方法試驗(yàn)

陳 未，周偉偉，卜仕金

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州225300；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225000）

氟尼辛（Flunixin）屬于非甾體類抗炎藥物（NSAIDs），主要通過抑制環(huán)氧化酶、減少前列腺素等炎性介質(zhì)的生成而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，獸醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛、效果確鑿。目前，氟尼辛的相關(guān)制劑產(chǎn)品在國內(nèi)獸醫(yī)臨床已批準(zhǔn)使用，但針對動(dòng)物源性食品中氟尼辛殘留量的檢測方法還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)研究建立了豬肌肉、皮脂腎臟、肝臟4種組織中氟尼辛殘留檢測的HPLC檢測方法，為進(jìn)一步加強(qiáng)動(dòng)物源性食品中該藥物的殘留監(jiān)控及消除規(guī)律研究提供了參考。、

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備 Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；R-210A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；組織勻漿機(jī)B-400（瑞士Buchi公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)（Hitachi公司）等。

1.2 試劑與材料 乙腈，色譜純（德國Merck公司）；甲醇，色譜純（德國Merck公司）；磷酸，優(yōu)級(jí)純（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；三乙胺，優(yōu)級(jí)純（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；三氯乙酸，分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PCX固相萃取小柱，300mg/6mL（美國Agilent公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：氟尼辛葡甲胺（flunixinmeglumine，F(xiàn)M），對照品：含量99%，批號(hào)81013，購自德國Augsburg公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試料制備與保存 取適量新鮮或解凍的未用藥空白豬組織（肌肉、肝臟、腎臟、皮膚及脂肪），絞碎并使均質(zhì)。取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料；取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料；取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試料。-20℃以下貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試液的配置：

2.2.1 氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（200μg/mL） 精確稱取氟尼辛葡甲胺標(biāo)準(zhǔn)品8.30mg，置于50mL容量瓶中，用80%甲醇水溶液定容至刻度，配制成濃度為200μg/mL的氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃以下保存，有效期6個(gè)月。

2.2.2 氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)工作液（10μg/mL） 準(zhǔn)確量取200μg/mL的氟尼辛的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用80%甲醇水溶液定容，配制成濃度為10μg/mL的氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃保存，有效期3個(gè)月。

2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后試料5（±0.05）g于50mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入無水硫酸鈉5 g，再加15mL 1%TCA-乙腈溶液，高速渦動(dòng)2min，5 000 r/min（10℃）離心5min，上清液入50mL聚丙烯帶蓋離心管中。下層殘?jiān)?5mL提取液重復(fù)提取1次，合并上清液，向離心管中加入10mL乙腈飽和的正己烷，高速渦旋1min后5 000 r/min（4℃）離心5min，棄上層液體，下層入100mL雞心瓶，并加入5mL的正丙醇于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。向蒸至近干的雞心瓶中加入3mL乙腈，渦旋振蕩3min，溶解殘?jiān)笠浦?0mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入9 mL 2%磷酸高速渦旋1min，4℃保存?zhèn)溆?。采用PCX陽離子交換柱進(jìn)行固相萃取，小柱依次用6mL甲醇活化、6mL水平衡，上樣后依次用6mL水、6mL甲醇淋洗，待小柱干燥后用6mL 10%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管內(nèi)，60℃下氮?dú)獯蹈?，殘留物?.0mL流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液供檢測。

2.4 色譜條件 色譜柱：伊利特ODS-2色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05mol/L磷酸三乙胺溶液（60/40，v/v，pH=3.8）；波長：333 nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：80μL；柱溫：30℃。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取2.2.2配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，依次用流動(dòng)相稀釋成5、2、1、0.5、0.1μg/mL和0.02μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。在選定的色譜條件下，按濃度從低到高的順序分別進(jìn)樣80μL作HPLC分析。每個(gè)濃度重復(fù)5次。以氟尼辛濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 檢測限與定量限測定 配制系列濃度氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)工作液添加于空白試料（肌肉、腎臟、肝臟、皮膚及脂肪）中，制得相應(yīng)組織藥物濃度，按2.3方法處理，重復(fù)5次，作HPLC測定。測得各樣品的峰高與噪音（基線峰高），取信噪比（S/N）≥3時(shí)的濃度為檢測限；結(jié)合準(zhǔn)確性和精密度試驗(yàn)，取信噪比（S/N）≥10時(shí)的濃度為定量限。

2.7 準(zhǔn)確性測定 準(zhǔn)確稱取空白試料，添加不同氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得不同添加濃度的供測樣品。經(jīng)2.3方法處理后，作HPLC測定；同時(shí)用對應(yīng)濃度的氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)液作HPLC測定。每一濃度分別重復(fù)5次。回收率的計(jì)算公式為：

式中：A為預(yù)處理后組織中氟尼辛的實(shí)測峰面積；As為對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液中氟尼辛的峰面積。

2.8 精密度測定 按2.7操作對各濃度樣品在同日內(nèi)重復(fù)測定5次，測得氟尼辛峰面積，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)；在一周內(nèi)不同日對4個(gè)濃度樣品進(jìn)行5次重復(fù)測定，測得氟尼辛的峰面積，計(jì)算日間變異系數(shù)。

2.9 計(jì)算方法 試樣中氟尼辛的殘留量（mg/kg）

計(jì)算式：

式中：X-試料中氟尼辛的殘留量，mg/kg；C-試樣溶液中氟尼辛的濃度，mg/L；V1-復(fù)溶用流動(dòng)相的總體積，mL；V2-過PCX固相萃取柱所用備用液體積，mL；V-定容用流動(dòng)相的總體積，mL；M-試料的質(zhì)量，g。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 色譜行為 氟尼辛對照品、空白組織、藥物添加樣品色譜圖分別見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 （0.2μg/mL）

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在建立的色譜條件下，用HPLC測定氟尼辛標(biāo)準(zhǔn)工作液中各個(gè)濃度，藥物濃度在0.02～5μg/mL范圍內(nèi)，各濃度與其響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系（R2≥0.999），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。在建立的色譜條件下，氟尼辛的標(biāo)準(zhǔn)品平均濃度與其平均峰面積的回歸方程為：

y=72604x+949.99（R2=0.9998）

3.3 檢測限和定量限 根據(jù)5個(gè)空白樣品的基線噪音值求其平均值，取信噪比S/N≥3時(shí)氟尼辛的最低濃度，測得氟尼辛在肌肉、皮脂、腎臟、肝臟4種組織的最低檢測限分別為10、6、15、15μg/kg；根據(jù)精密度和準(zhǔn)確度測定結(jié)果，取信噪比S/N≥3時(shí)氟尼辛的最低濃度，測得氟尼辛在肌肉、皮脂、腎臟、肝臟4種組織的最低定量限分別為25、10、30、30μg/kg。

3.4 添加回收率 豬肌肉在25、50、500μg/kg和1 000μg/kg4個(gè)添加濃度的平均回收率分別為83.66±3.97%、86.27±3.98%、82.76±5.37%、86.98±4.72%；豬皮膚及脂肪在10、20、500μg/kg和1 000 μg/kg 4個(gè)添加濃度水平的平均回收率分別為84.71±5.17%、86.62±4.11%、87.92±5.31%、90.69±4.32%；豬腎臟在30、60、500μg/kg和1 000μg/kg 4個(gè)添加濃度水平的平均回收率分別為79.55±5.33%、81.27±3.87%、84.56±7.27%、87.43±6.26%；豬肝臟在30、60、500μg/kg和1 000μg/kg 4個(gè)添加濃度水平的平均回收率分別為77.05±3.40%、78.98±5.50%、80.50±5.56%、78.49±3.06%。

3.5 精密度 豬肌肉、皮膚及脂肪、腎臟和肝臟中在3.4不同添加濃度的氟尼辛殘留精密度見表1。

表1 豬組織樣品精密度測定

4 討論

氟尼辛含有羧基和氨基，極性較大，在酸性條件下容易形成正離子。因此，利用酸性溶液提取，并利用陽離子交換柱進(jìn)行凈化和富集就成了首選方法。豬組織中脂肪和蛋白質(zhì)含量較高，如何除去脂肪和沉淀蛋白成為試驗(yàn)的關(guān)鍵。三氯乙酸（TCA）是常用的酸性蛋白沉淀劑[1]，采用乙腈和TCA的混合提取液?？瞻滋砑釉囼?yàn)發(fā)現(xiàn)，各組織中藥物回收率在71.9%～98.6%之間，色譜圖中雜質(zhì)對于藥物響應(yīng)干擾程度小，滿足檢測要求。當(dāng)三氯乙酸的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)大于1%時(shí)將會(huì)影響藥物與交換柱之間的鍵合，故本試驗(yàn)采用1%TCA-乙腈溶液作為提取液。

有研究發(fā)現(xiàn)[2]，C18柱對氟尼辛雖有較強(qiáng)的富集能力，但藥物難以洗脫，添加回收率在50%～60%范圍內(nèi)，不能滿足檢測要求。SCX陽離子交換柱去雜質(zhì)效果明顯，對肌肉和皮脂空白添加的氟尼辛富集效果較好，但對腎臟及肝臟空白添加氟尼辛富集效果不理想。本試驗(yàn)最終選定Plexa PCX作為本檢測方法的固相萃取柱。此種萃取柱結(jié)合了優(yōu)秀的表面親水性，并在聚合物基體的羥基化表面鍵合了磺?；變?nèi)部為疏水特性，經(jīng)過活化后具有獨(dú)特的極性梯度表面，從而有效降低離子抑制效應(yīng)，離子交換機(jī)理可以去除樣品基質(zhì)中的中性和酸性干擾物，對堿性分析物萃取濃縮，可以有效提高方法的靈敏度、定量和分析能力。

非甾體類藥物殘留檢測方法中大多采用C18色譜柱及反相高效液相色潽法，以有機(jī)溶劑/水溶液體系做流動(dòng)相[3]。余祖功等[4]建立的血漿中氟尼辛殘含量測定高效液相色譜法，雜質(zhì)峰對藥物峰有較大干擾，不適合本研究的藥物殘留檢測?？涤婪宓萚5-7]建立的超聲-波微波輔助提取-高效液相色譜法同時(shí)檢測羊肉組織中4種非甾體抗炎藥物殘留方法能夠?qū)⑺幬锓迮c雜質(zhì)峰分開，峰形較好，氟尼辛的響應(yīng)值（峰面積）比較大。本研究基于上述試驗(yàn)研究結(jié)果，經(jīng)過優(yōu)化，最終選擇甲醇-0.05mol/L磷酸三乙胺（60∶40 v/v,用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.8）作為流動(dòng)相，流動(dòng)相中加入三乙胺能消除色譜柱填料表面硅羥基的作用，改善氟尼辛的峰形，增大了靈敏度，pH=3.8有利于色譜柱對藥物的分離作用[8]。

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