重慶某牛場乳房炎病原菌分離鑒定及藥物敏感試驗(yàn)

周文君，孫裕光，沙 莎

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

乳房炎是由于病原微生物侵入奶牛乳腺組織所引起的一種嚴(yán)重危害奶牛業(yè)發(fā)展的常見病、多發(fā)病。主要引起乳房炎的致病菌已報(bào)道約80多種，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等。環(huán)境的微生物也是引起牛乳房炎的另一致病因素，如肺炎克雷伯菌、假單胞菌等革蘭陰性病原菌等[1]?？股貫榕R床治療牛乳房炎的首選藥物，但因抗生素導(dǎo)致的耐藥性給乳房炎的治療帶來很大的困難，在對乳房炎藥物治療過程中的藥物殘留也成為牛奶品質(zhì)和牛乳食品安全的一大隱患。本試驗(yàn)對該牛場患乳房炎奶牛的乳汁進(jìn)行病原菌分離鑒定以及藥敏試驗(yàn)，以期獲得患病牛乳的細(xì)菌種類和敏感藥物或耐藥菌株存在狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 樣品為重慶市某奶牛場患臨床型或亞臨床型乳房炎牛奶，如乳房紅、腫，部分乳房出現(xiàn)萎縮或硬塊；表現(xiàn)產(chǎn)奶量下降癥狀的病牛。每頭病牛采集的牛乳樣品為1份：采樣前消毒乳房及4個(gè)乳區(qū)，各乳區(qū)采乳約10mL，盛于滅菌燒瓶中。共采10頭牛，10份樣品混合，暫保存于4℃的冰箱，72 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離，獲得菌株。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯等按常規(guī)方法制作。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定所用的微量發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號：20120301，20120111。紅霉素、恩諾沙星、氨芐青霉素、鏈霉素、頭孢噻吩、乙酰螺旋霉素、阿莫西林、氟哌酸、磺胺異惡唑等試驗(yàn)用藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號：110817。

1.3 試驗(yàn)動物 昆明系小鼠60只，購自瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，養(yǎng)1周后用于致病性試驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及計(jì)數(shù) 無菌操作，取10-1稀釋乳樣0.2mL，用“L”棒涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，挑取培養(yǎng)基上的不同生長特征的菌落進(jìn)行純化，將純培養(yǎng)物編號保存，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 分離菌形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特性觀察 將已純化菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢，并觀察菌落生長特性及在不同基質(zhì)上生長狀況。

1.4.3 分離菌生化鑒定 按細(xì)菌編碼鑒程序?qū)Ψ蛛x純化的細(xì)菌分別進(jìn)行生化鑒定：G-、氧化酶試驗(yàn)陰性菌直接用腸桿菌科細(xì)菌編碼鑒定。G-、氧化酶試驗(yàn)陽性、O／F試驗(yàn)陽性菌通過厭氧葡萄糖試驗(yàn)即可進(jìn)行弧菌科生化編碼鑒定。G+球菌通過觸酶、葡萄糖發(fā)酵、玻片凝固酶、試管凝固酶、新生霉素試驗(yàn)、動力和溶血試驗(yàn)鑒定；試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊和常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊判定細(xì)菌種類。部分G+桿菌使用BIOFOSUNGP48板條用BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng)（上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司）鑒定。

1.4.4 分離菌致病性試驗(yàn) 將60只小鼠隨機(jī)分成12組[2]，11組做試驗(yàn)組，1組做對照組，每組5只，隔離飼養(yǎng)。將分離的11株菌的24h肉湯培養(yǎng)物對小鼠進(jìn)行腹腔注射0.2mL/只（1.5×109/mL），對照組注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只。觀察記錄小鼠的存活情況。死亡者剖檢觀察病變并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.4.5 致病菌藥敏試驗(yàn) 用引起小鼠死亡的菌株和常用抗生素藥紙片，按紙片擴(kuò)散法（Kirby-Baueer Dise Diffusion）進(jìn)行試驗(yàn)。37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測量抑菌圈的直徑，以CLSI的判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 樣本細(xì)菌分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 患乳房炎的乳汁樣本中平均細(xì)菌總數(shù)1.42×103CFU/mL，少于國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 19301-2010鮮牛標(biāo)準(zhǔn)（2×106CFU/mL）。從中分離到11株細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2.2 分離菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定 樣本中11株細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定有8種菌：YR-1、YR-3、YR-7為嗜水氣單胞菌，占分離菌27.3%；YR-2、YR-5為微球菌，占分離菌18.2%；YR-4為鮑曼不動桿菌，占分離菌9.1%；YR-6為表皮葡萄球菌，占分離菌9.1%；YR-8為枯草桿菌，占分離菌9.1%；YR-9為溫和氣單胞菌，占分離菌9.1%；YR-10為克里斯坦森耶爾森氏菌，占分離菌9.1%；YR-11為海魚弧菌，占分離菌9.1%。鮮血瓊脂培養(yǎng)基上鮑曼不動桿菌(YR-4)呈β溶血，枯草桿菌（YR-8）呈α溶血。

2.3 分離菌致病性試驗(yàn) 樣本中8種細(xì)菌，有5種菌具有致病性，分別是表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、嗜水氣單胞菌、枯草桿菌和微球菌，致病菌的檢出率為54.5%。其中表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌致病力最強(qiáng)，試驗(yàn)小鼠100%死亡，微球菌、鮑曼不動桿菌和枯草桿菌使試驗(yàn)小鼠80%死亡，死亡小鼠均出現(xiàn)不同程度的敗血癥癥狀；對病死小白鼠的臟器分離培養(yǎng)鑒定，均回收到原菌。另外克里斯坦森耶爾森氏菌、海魚弧菌、溫和氣單胞菌接種的小鼠未出現(xiàn)死亡。對照組小鼠未見不良癥狀。

2.4 藥敏試驗(yàn) 選用鏈霉素、諾氟沙星等9種常用藥物和5種致病性菌作藥敏試驗(yàn)。結(jié)果（見表1）：嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物耐藥，枯草桿菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩、阿莫西林和磺胺藥物耐藥。其他的菌株對這9種藥物均敏感。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 （株）

3 分析與討論

該奶牛場是重慶市某奶牛產(chǎn)業(yè)鏈中奶牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中的一個(gè)，由各個(gè)奶牛養(yǎng)殖場組成的養(yǎng)殖集團(tuán)生產(chǎn)鮮乳，鮮奶的質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要，了解牛養(yǎng)殖場奶牛乳房炎基本狀況可以為科學(xué)養(yǎng)殖管理提供科學(xué)依據(jù)。

樣本細(xì)菌總數(shù)的結(jié)果少于國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)其原因或是使用抗生素藥物治療乳房炎的緣故。在樣本中分離鑒定出8種11株菌，其中嗜水氣單胞菌、微球菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌和枯草桿菌5種菌對小白鼠有致病性。從細(xì)菌的種類上比較，該牛場致病菌種類與文獻(xiàn)報(bào)道[1-8]結(jié)果略有不同，其中鮑曼不動桿菌、嗜水氣單胞菌在乳房炎病例中少有報(bào)道。表皮葡萄球菌和嗜水氣單胞菌致病力最強(qiáng)，可使試驗(yàn)小白鼠100%死亡，是引發(fā)該奶牛場乳房炎的主要病原。鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見致病菌之一，為條件致病菌[6]。枯草桿菌在通常情況下為非致病菌，但某些情況下枯草桿菌亦可導(dǎo)致人體感染[7]。此時(shí)在乳房炎牛乳中發(fā)現(xiàn)并使試驗(yàn)小鼠80%死亡，說明鮑曼不動桿菌和枯草桿菌是主要的致病因素之一。嗜水氣單胞菌在樣本中分離出說明牛場環(huán)境有嗜水氣單胞菌污染，環(huán)境條件惡劣，牛體抵抗力低下時(shí)，可造成乳房炎的發(fā)生。樣本中有微球菌的結(jié)果與報(bào)道同[8]。此外在乳樣中還有克里斯坦森耶爾森氏菌、海魚弧菌、溫和氣單胞等條件致病菌[10]，雖檢出率均低為10%,并且未引起小鼠死亡，但這些菌的生存條件是濕熱環(huán)境；牛舍環(huán)境潮濕為致病菌和條件致病菌提供溫床。當(dāng)動物機(jī)體的抵抗力下降，使動物感染疾病的機(jī)率增加，牛乳房炎亦是如此。

臨床上抗生素為治療牛乳房炎的首選藥物，試驗(yàn)結(jié)果顯示嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物耐藥，枯草桿菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩、阿莫西林和磺胺藥物耐藥。其中氨芐青霉素、頭孢噻吩藥物為廣譜抗菌藥，常用于臨床用藥，嗜水氣單胞菌對產(chǎn)生耐藥的原因可能不僅僅是因?yàn)榕R床的濫用，也可能是因?yàn)槭人畾鈫伟墚a(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素有關(guān)[8]。在臨床治療時(shí)應(yīng)避免選擇已產(chǎn)生耐藥的氨芐青霉素、頭孢噻吩等藥物，而鏈霉素和氟哌酸等藥物對該牛場致病菌有較好的抑菌效果。另外紅霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[5]，對部分革蘭陰性菌有抑菌作用，鮑曼不動桿菌在結(jié)果中顯示對紅霉素敏感，這一結(jié)果少有報(bào)道，或可為鮑曼不動桿菌研究和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗菌研究提供素材。

綜上所述，試驗(yàn)研究證明該牛舍環(huán)境潮濕，飼養(yǎng)狀況差是該牛場存在的問題之一，在對乳房炎進(jìn)行治療時(shí)，除了使用抗菌敏感藥物外，還應(yīng)全方位改善飼養(yǎng)環(huán)境，定期對牛群排查、治療，及時(shí)消除潛在的隱患，以減少奶牛乳房炎帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

[1]馮萬字，史同瑞，許臘梅.奶牛乳房炎的診斷與防制研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（4）：79.

[2] 萬霞，劉建平.臨床試驗(yàn)中的隨機(jī)分組方法[J].中醫(yī)雜志，2007，48（3）：216-219.

[3]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002，19-66.

[4] 張福臣.牛乳房炎的危害及防治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2010（4）：65.

[5]鄭忠輝，石和鵬，等.大環(huán)內(nèi)脂抗生素的發(fā)展與展望[J].藥學(xué)進(jìn)展，2005，29（1）：2.

[6]徐秀華.臨床醫(yī)院感染學(xué)[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1998：308-309.

[7]史凱.新生兒枯草杯菌敗血癥33例臨床分祈[J].臨床兒科雜志，1992，6：400-401.

[8]Bakken JS，Sanders C C，Clark R B，et al.β-lactam resistance in Aeromonas Spp.caused by induciblelβ-lactamases active against penicillins,cephalosporins andβ-lactamases active against penicillins,cephalosporins and carbapenems[J].Antimicrob Agents Chemother，1998，32（9）：1314-1319.

[9]Major causes ofmastitis and associated risk factors in smallholder dairy cows in Shashemene,southern Ethiopia African Journal of Agricultural Research 1991-637X，Volume 26Jun，Issue 26Jun，2012，Pages 3513-3518.

[10]R E布坎南.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，1984.