下調(diào)miRNA-155 對(duì)糖尿病加重腦缺血損傷的影響

韓江全，盧俊江，向燦輝，劉承靈，王正遠(yuǎn)，劉 玲，陳 玲

腦梗死是糖尿病的嚴(yán)重血管并發(fā)癥，糖尿病合并急性腦梗死占腦梗死的20%～25%，且梗死面積更大、癥狀更重，更容易形成進(jìn)展性卒中，預(yù)后更差［1，2］。目前對(duì)糖尿病性腦梗死仍未尋找出有效可行的治療措施。miRNAs 是一類小分子非編碼RNA，約由20～22 個(gè)堿基組成。有研究結(jié)果顯示，miRNAs 可通過(guò)調(diào)控其靶mRNA 翻譯過(guò)程發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用，從而廣泛參與細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等多種生物現(xiàn)象［3］。有研究結(jié)果顯示，腦缺血損傷后，以及在多種腦損傷同時(shí)存在的情況下，miRNA-155s 表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化［4，5］，提示miRNA-155在腦缺血損傷中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA-155具有多種生物學(xué)功能，抑制miRNA-155 具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)腦缺血損傷有益［5，6］。我們通過(guò)使用人工合成miRNA-155 抑制物下調(diào)糖尿病大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)組織內(nèi)miRNA-155 水平，觀察miRNA-155 對(duì)糖尿病大鼠腦缺血損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD 大鼠購(gòu)買自遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RNA 抽提試劑盒miRNeasy Mini 購(gòu)買自Qiagen 公司;TaqMan?MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液以及TaqMan?MicroRNA Assays 購(gòu)自Applied Biosystems by Life Technologies 公司;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑購(gòu)自Sigma 公司;鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma 公司;TNF-α 羊抗多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;miR-155 抑制物及陰性對(duì)照核苷酸購(gòu)自上海吉瑪生物公司。miR-155 抑制物及其陰性對(duì)照核苷酸均溶解于滅菌生理鹽水中，濃度為0.2 g/L。

1.2 模型的制備

1.2.1 糖尿病動(dòng)物模型建立 STZ 用0.1 mmol/L 檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.2)在冰浴中配制10 mg/L 濃度。禁食8 h 大鼠于左下腹腹腔注射STZ 55 mg/kg。用羅氏血糖儀測(cè)定大鼠尾尖血血糖，穩(wěn)定7 d 后。癥狀表現(xiàn)為多飲、多食、多尿，空腹血糖＞16.7 mmol/L 的大鼠確定為糖尿病大鼠。

1.2.2 永久性局灶性腦缺血模型的建立 采用Longa 線栓法建立永久性大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型，均予阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈24 h。糖尿病大鼠于注射STZ 后6 w 進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60 只，周齡8～12 w，體重240～280 g，均衡飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。隨機(jī)分為6 組:(1)假手術(shù)組(sham 組):不阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈，于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(2)腦缺血組(CI 組):于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(3)糖尿病腦缺血組(DCI 組):糖尿病大鼠于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水;(4)糖尿病腦缺血+miRNA-155 抑制物組(inhibitor 組):糖尿病大鼠于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射miRNA-155 抑制物10 μg;(5)糖尿病腦缺血+陰性對(duì)照組(scramble組):糖尿病大鼠于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射miRNA-155 陰性對(duì)照核苷酸10 μg;(6)糖尿病腦缺血+生理鹽水組(NS 組):糖尿病大鼠于腦缺血5 min 時(shí)經(jīng)側(cè)腦室注射等容量生理鹽水。每組均10只大鼠。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Z(yǔ)ea-Longa 5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于缺血24 h 對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分紀(jì)錄。2 分或2 分以上者為造模成功。

1.5 梗死體積測(cè)定 各組動(dòng)物在腦缺血后進(jìn)行過(guò)量麻醉處死，迅速斷頭取腦，放入冷凍冰箱凍至適當(dāng)?shù)挠捕?，以前額極起行冠位切片，每2.0 mm 切一片，每只大鼠大腦大約切4～6 片，置于2% 氯化三苯基四氮唑生理鹽水中，37 ℃孵育15～30 min，正常腦組織呈深紅色，梗死灶呈白色，在手術(shù)照射燈下拍照，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析儀測(cè)出梗死灶體積。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)miRNA-155 表達(dá) 腦缺血3 h 后，取大鼠腦皮質(zhì)區(qū)組織標(biāo)本。使用miRNeasy Mini 試劑盒提取總RNA。根據(jù)TaqMan?MieroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明將RNA 樣品逆轉(zhuǎn)錄。將獲得cDNA 稀10 倍后使用TaqMan?MicroRNA Assays 及TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng)。采用U6 為內(nèi)參基因。通過(guò)2-ΔΔCT 法統(tǒng)計(jì)各組間miRNA-155 相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫組化檢測(cè)TNF-α 表達(dá) 采用鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC)法，按照TNF-α 免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。陰性對(duì)照，一抗采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一起切片，并同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，以確保條件的一致性。光鏡下觀察各組大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域TNF-α 陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞核中有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞)的表達(dá)變化。用MiVnT 顯微生物圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化圖像定量分析，所測(cè)得的陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值(average grey level)表示TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱。平均灰度值越小，表示染色越深，TNF-α 的表達(dá)也就越強(qiáng)。在每個(gè)標(biāo)本的缺血周圍區(qū)隨機(jī)測(cè)量5 個(gè)不重疊視野，每個(gè)視野又選取5 個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)量平均灰度，取其平均值代表此例標(biāo)本該區(qū)域的平均灰度值。

1.8 Western blot 檢測(cè)TNF-α 表達(dá) 大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，冰上研磨組織后加預(yù)冷的蛋白裂解液，繼續(xù)碾磨至液態(tài)，然后4 ℃，12000 r/min 離心30 min，留上清液，取40 μl 用BCA 法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，所剩上清液按4∶1 的比例加變性loading，100 ℃水浴10 min。取蛋白樣品(40 μg)采用10% SDSPAGE100V 垂直電泳(Bio-Rad 垂直板式電泳槽儀，USA)120 min 進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上進(jìn)行免疫反應(yīng)(200 V，120 min)。5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，然后加入兔抗TNF-α 抗體(1∶500)，37 ℃孵育2 h，4 ℃過(guò)夜;偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物(HRP)羊抗兔IgG(稀釋濃度1∶2000)室溫孵育2 h，LumiGLO(20×)發(fā)光劑中X-感光盒內(nèi)曝光。以上反應(yīng)均在塑料袋內(nèi)進(jìn)行，其間用PBS 充分洗滌。為了檢測(cè)蛋白裂解/轉(zhuǎn)移的變化，所有的印跡均以麗春紅(抗體孵育前)和考馬斯亮藍(lán)(化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)后)染色。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，采用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blot 條帶的平均吸光度(A)值，內(nèi)參為β-action，目的蛋白與β-action 吸光度比值即為目的蛋白的相對(duì)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組造模前血糖值 Sham 組為(5.78±0.32)，CI 組為(5.90±0.27 mmol/L)，DCI 組為(16.96±1.65 mmol/L)，Inhibitor 組為(16.93±1.15 mmol/L):Scramble 組為(16.97±1.53 mmol/L)，NS 組為(16.92±1.43 mmol/L)。DCI 組、Inhibitor 組、Scramble組及NS 組的血糖水平明顯高于CI 組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而DCI 組、Inhibitor 組、Scramble 組與NS 組4 組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 miRNA-155 抑制物下調(diào)miRNA-155 表達(dá)效果 Real-time PCR 結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射miRNA-155 抑制物顯著下調(diào)糖尿病大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)miRNA-155 表達(dá)水平。而Scramble 組及NS 組miRNA-155 表達(dá)水平無(wú)顯著改變(見(jiàn)表1)。

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 Sham 組未見(jiàn)神經(jīng)功能缺損，其余各組大鼠在麻醉清醒后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。使用miRNA-155 抑制物下調(diào)miRNA-155 表達(dá)水平后，糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較DCI 組顯著減少(P＜0.05)，Scramble 及NS 對(duì)糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分無(wú)顯著影響(見(jiàn)表1)。

2.4 梗死體積 Sham 組未見(jiàn)有白色梗死區(qū)域，其余各組腦缺血側(cè)可見(jiàn)到明顯的白色梗死區(qū)。使用miRNA-155 抑制物下調(diào)miRNA-155 表達(dá)水平后，糖尿病腦缺血大鼠的梗死體積較DCI 組顯著減少(P＜0.05)，使用Scramble 及NS 后對(duì)糖尿病腦缺血大鼠的梗死體積無(wú)顯著影響(見(jiàn)表1)。

2.5 TNF-α 表達(dá)Sham 組有少量TNF-α 表達(dá)其余各組缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)TNF-α 表達(dá)明顯增多。使用miRNA-155 抑制物下調(diào)miRNA-155 表達(dá)水平后，糖尿病腦缺血大鼠的TNF-α 表達(dá)較DCI 組顯著減少(P＜0.05)，使用Scramble 及NS 后對(duì)糖尿病腦缺血大鼠的TNF-α 表達(dá)無(wú)顯著影響(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、miRNA-155 及TNF-α 表達(dá)水平比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、miRNA-155 及TNF-α 表達(dá)水平比較(±s，n=10)

與Sham 組比較aP＜0.05;與CI 組比較bP＜0.05;與DCI 比較cP＜0.05

3 討論

糖尿病是腦血管病發(fā)病加重的重要危險(xiǎn)因素，它不僅能夠誘發(fā)腦缺血，而且能夠使腦缺血損傷進(jìn)一步加重。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與腦缺血組相比，糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加，梗死面積顯著增大(P＜0.05);從行為學(xué)及形態(tài)學(xué)方面進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病可加重腦缺血損傷，與既往研究報(bào)道［1，2］一致，提示糖尿病對(duì)缺血性腦損傷有加強(qiáng)效應(yīng)。目前對(duì)糖尿病性腦梗死仍未尋找出有效可行的治療措施，深入研究糖尿病加重腦缺血的病理機(jī)制，探尋有效可行的治療措施及其治療靶點(diǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

miRNA 是一類進(jìn)化上保守的非編碼單鏈小RNA，長(zhǎng)19～24 個(gè)核苷酸，能在轉(zhuǎn)錄后降解靶基因mRNA 或抑制基因的翻譯。每一種miRNA 可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶mRNA 表達(dá)，對(duì)生物體的基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著極其廣泛的作用［3］。盡管miRNA 調(diào)控著機(jī)體一些生理狀況及疾病的發(fā)生發(fā)展，一些研究也顯示miRNA 在神經(jīng)元死亡與變性中的意義［7］。近年來(lái)通過(guò)分析腦缺血模型miRNA 的表達(dá)模式，腦缺血損傷后miRNA 的表達(dá)變化以及miRNA 調(diào)控缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用已逐漸被揭示。已經(jīng)證明，miRNA 參與調(diào)控腦缺血病理生理過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)，拮抗某些miRNA 具有神經(jīng)保護(hù)作用［8，9］，但有關(guān)miRNA-155 在糖尿病加重腦缺血損傷中的作用迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。

miRNA-155 是近年來(lái)研究揭示的，位于人類21號(hào)染色體上Bic 基因的第3 個(gè)外顯子內(nèi)，為外顯子中一段138 個(gè)核苷酸保守序列編碼miRNA-155 的前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)。成熟miRNA-155 序列為:5 ’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3 ’。miRNA-155主要來(lái)源于活化的淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)而參與多種病理生理過(guò)程［10］。研究發(fā)現(xiàn)，永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型其海馬區(qū)及外周血中miRNA-155表達(dá)出現(xiàn)顯著改變［4］;新近研究在其大腦皮質(zhì)區(qū)亦可見(jiàn)miRNA-155 表達(dá)明顯上調(diào)［5］。而在多種腦損傷同時(shí)存在的情況下，miRNA-155 等miRNA 在腦組織中的表達(dá)亦會(huì)有顯著的改變［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與腦缺血組相比較，糖尿病腦缺血組大鼠皮質(zhì)區(qū)miRNA-155 表達(dá)明顯上調(diào)，一方面提示miRNA-155表達(dá)具有廣泛性及作用機(jī)制的復(fù)雜性;另一方面也表明miRNA-155 可能參與了糖尿病加重腦缺血損傷的病理生理過(guò)程。

糖尿病加重腦缺血損傷過(guò)程是腦缺血與糖尿病共同作用的結(jié)果，其機(jī)制與炎癥反應(yīng)以及免疫密切相關(guān)［1，2］。其中，炎癥因子的激活及其釋放在炎癥過(guò)程中扮演著重要的角色，構(gòu)成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)［11］。高血糖、腦缺血及再灌注損傷可引起細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β 等的表達(dá)，影響炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大炎癥效應(yīng)，最終導(dǎo)致腦損傷加重［12］。而miRNA-155 具有促炎性作用，與腦缺血后炎性反應(yīng)密切相關(guān)［5，13］。神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖刺激后，miRNA-155 表達(dá)明顯上調(diào);敲除miRNA-155后，則細(xì)胞因子信號(hào)1 抑制蛋白(SOCS-1)顯著上調(diào)，一氧化氮產(chǎn)生以及炎癥細(xì)胞因子、誘導(dǎo)一氧化氮合酶表達(dá)明顯減少;原代培養(yǎng)神經(jīng)元在miRNA-155 被抑制的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，則減少神經(jīng)元死亡［5，6］。此外，與野生型小鼠相比，miR-155 基因敲除小鼠給予LPS 注射后，血漿中TNF-α 的水平較低;相反，在高表達(dá)miR-155 的轉(zhuǎn)基因小鼠中，給予LPS體內(nèi)注射后，血漿中TNF-α 的水平則遠(yuǎn)比野生型小鼠高［14，15］，而抑制miR-155 的表達(dá)可削弱LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答，減少TNF-α 等炎癥介質(zhì)的生成［16］，因此，抑制miRNA-155 表達(dá)可能具有神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)腦缺血損傷產(chǎn)生有益作用［5，6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腦缺血組相比較，糖尿病腦缺血大鼠TNF-α 及miRNA-155 表達(dá)明顯上調(diào)，神經(jīng)功能評(píng)分明顯增加，梗死面積顯著增大;而抑制miRNA-155 表達(dá)，則TNF-α 表達(dá)明顯下調(diào)，糖尿病腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分顯著減少、梗死面積減小，這一方面提示miRNA-155 對(duì)糖尿病加重腦缺血損傷有著重要的調(diào)控作用;另一方面提示miRNA-155 有可能成為治療糖尿病腦梗死新的靶點(diǎn)。

［1］Bruno A.Management of hyperglycemia during acute stroke［J］.Curr Cardiol Rep，2009，11(1):36-41.

［2］韓江全，吳俊雄，胡泳濤，等.超負(fù)荷血糖對(duì)鼠局灶性腦缺血側(cè)皮質(zhì)內(nèi)皮抑素 表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29(4):321-324.

［3］Filip A.MiRNA-new mechanisms of gene expression control［J］.Postepy Biochem，2007，53(4):413-419.

［4］Liu Da-Zhi，Tian Yingfang，Ander Bradley P，et al.Brain and blood microRNA expression profiling of ischemic stroke，intracerebral hemorrhage and kainate seizures［J］.J Cerebral Blood Flow ＆ Metabolism，2010，30(1):92-101.

［5］Joshua GH，Emily BF，Zhifei Wang，et al.Post-insult valproic acidregulated microRNAs:potential targets for cerebral ischemia［J］.Am J Transl Res，2012，4(3):316-332.

［6］Ana LC，Joana RG，Luis Pereira de Almeida，et al.miR-155 modulates microglia-mediated immune response by down-regulating SOCS-1 and promoting cytokine and nitric oxide production［J］.Immunology，2012，135(1):73-88.

［7］Soon-Tae Lee，Kon Chu，Keun-Hwa Jung，et al.Micro RNAs induced during ischemic preconditioning［J］.Stroke，2010，41(8):1646-1651.

［8］Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，2008，39(3):959-966.

［9］Dharap A，Bowen K，Place R，et al.Vemuganti R.Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral microRNAome［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(4):675-687.

［10］Isabella F，F(xiàn)rancesca RA，John C，et al.miR-155 gene:A typical multifunctional microRNA［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2009，1792(6):497-505.

［11］Liu Qichun，Xiao Hui，Tang Chunliu.The inflammation after brain ischemia and its treatment prospect［J］.J International Neurology and Neurosurgery，2009，36(1):592-562.

［12］Domanska JK，Bronisz KA，Zajac H，et al.Interrelations between nucler-factor kappa B activation，glial response and neuronal apoptosis in gerbil hippocampus after ischemia［J］.Acta Neumbio Exp(Warsz)，2001，61(1):45-51.

［13］Yan H，F(xiàn)ang M，Liu XY.Role of microRNAs in stroke and poststroke depression［J］.Scientific World Journal，2013，(2):1-6.

［14］Tili E，Michaille JJ，Cimino A，et al.Modulation of miR-155 and miR-125 blevels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles in regulating the response to endotoxin shock［J］.J Immunol，2007，179(8):5082-5089.

［15］Sonkoly E，Pivarcsi A.microRNAs in inflammation［J］.Int Rev Immunol，2009，28(6):535-561.

［16］Androulidaki A，Iliopoulos D，Arranz A，et al.The kinase Aktl controls macrophage response to lipopolysaccharide by regulating microRNAs［J］.Immunity，2009，31(2):220-231.