天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組測(cè)定方法優(yōu)化及其代謝特征

李宜鴻，李珊珊，艾國(guó)民，王為善，張部昌，楊克遷

1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601

2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

鏈霉菌能夠產(chǎn)生眾多具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。其模式生物天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor在2002年就已經(jīng)完成基因組測(cè)序，具有清晰的遺傳背景[1]。同時(shí)，該菌株能夠產(chǎn)生具有顏色的紅色次級(jí)代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素 (Undecylprodigiosin，Red) 與藍(lán)色次級(jí)代謝產(chǎn)物放線紫紅素(Actinhordin，Act)。因此，該菌是研究抗生素生物合成調(diào)控和鏈霉菌代謝工程改造的理想對(duì)象。

隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)研究的地位日益顯著。代謝物作為生物信息傳遞的終端層次，在基因功能詮釋和代謝狀態(tài)分析等方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。代謝物組學(xué)是一種通過定性定量測(cè)量生物體代謝產(chǎn)物的種類和濃度變化，分析系列關(guān)聯(lián)代謝物的綜合差異，從而發(fā)現(xiàn)生物系統(tǒng)對(duì)基因以及環(huán)境變化響應(yīng)的研究方法[2-3]。由于代謝物組學(xué)能夠從系統(tǒng)生物學(xué)的高度集中闡釋生物體代謝所反映的全部信息，因此越來越多地受到科學(xué)家們的重視。代謝物組學(xué)在工業(yè)微生物領(lǐng)域的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：快速識(shí)別微生物在培養(yǎng)過程中的生理與代謝特征[4]；發(fā)現(xiàn)菌株新的代謝途徑[5]；從系統(tǒng)水平闡述微生物代謝調(diào)控機(jī)制[6]；理性指導(dǎo)菌株改造、提高靶標(biāo)代謝物的產(chǎn)量并指導(dǎo)發(fā)酵過程優(yōu)化[7]等。在工業(yè)微生物領(lǐng)域，代謝物組學(xué)的研究工作主要集中于酵母、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等模式微生物[6-9]。近期，也有部分針對(duì)鏈霉菌的研究工作[9-10]。由于鏈霉菌可產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而目前根據(jù)基因簇所獲得的化合物信息仍然有限，因此，研究鏈霉菌胞外次級(jí)代謝物組，可以發(fā)現(xiàn)新的次級(jí)代謝化合物，并促進(jìn)對(duì)次級(jí)代謝合成基因簇的認(rèn)識(shí)[10]。此外，代謝物組學(xué)也可以用于研究鏈霉菌對(duì)環(huán)境壓力的響應(yīng)機(jī)制[11]。這些研究工作表明，對(duì)于具有復(fù)雜生理代謝的鏈霉菌而言，代謝物組學(xué)這一研究手段可以發(fā)揮重要的作用。

代謝物組學(xué)研究依賴的技術(shù)平臺(tái)主要有核磁共振 (NMR) ，以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，包括氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜 (CE-MS)。其中，由于GC-MS具有靈敏度高、分辨率高和可選擇性地分離和檢測(cè)大量痕量代謝物和同質(zhì)異構(gòu)體等優(yōu)點(diǎn)，成為微生物代謝物組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的分析方法[12]。代謝物組學(xué)研究方法可分為 3個(gè)主要部分：樣品制備、代謝物檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析 (圖1) 。其中，獲得能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞瞬時(shí)狀態(tài)的代謝物樣品是該方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微生物生長(zhǎng)條件和狀態(tài)各異，因此，分離胞內(nèi)外代謝物方法也有所不同。對(duì)于研究較多的大腸桿菌 (革蘭氏陰性菌)、枯草芽胞桿菌 (革蘭氏陽(yáng)性菌) 和酵母菌 (真菌) 而言，已有不少研究者對(duì)其代謝物組學(xué)樣品制備方法進(jìn)行了摸索優(yōu)化[13-14]。對(duì)于鏈霉菌，目前卻仍無(wú)針對(duì)性的樣品制備方法優(yōu)化報(bào)道。由于獲得能夠準(zhǔn)確捕捉代謝物信息的測(cè)試樣品對(duì)研究鏈霉菌代謝行為及指導(dǎo)抗生素代謝工程具有重要意義，因此有必要對(duì)鏈霉菌樣品制備方法進(jìn)行優(yōu)化。

本工作以天藍(lán)色鏈霉菌為研究對(duì)象，對(duì)其代謝物組樣品制備方法進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，并利用GC-MS分析平臺(tái)分析了該菌株的主要代謝特征。此外，本工作還利用優(yōu)化的樣品制備方法比較了天藍(lán)色鏈霉菌 M145在不同生長(zhǎng)階段各個(gè)代謝途徑的相對(duì)強(qiáng)度，找出了這些代謝途徑和次級(jí)代謝生物合成的相關(guān)性，可以為其他鏈霉菌的代謝物組分析工作提供參考。

圖1 代謝物組學(xué)分析流程Fig. 1 Flowchart for a standard protocol of metabolome analysis.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株為天藍(lán)色鏈霉菌M145。

1.1.2 試劑

衍生化試劑甲氧氨鹽酸鹽、N-甲基-N- (三甲基硅基) 三氟乙酰胺 (MSTFA)，以及內(nèi)標(biāo)物琥珀酸-2,2,3,3-d4均購(gòu)自Sigma公司。甲醇、吡啶和正已烷試劑均為色譜級(jí)別。其他試劑均為分析純級(jí)別。

1.1.3 主要儀器

Agilent GC-MS (Agilent 7896A/5975C GC/MS)、高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf 5415R)、超低溫冰箱 (DW-86L626)、真空冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50)、真空泵 (GM-0.33a)、酶標(biāo)儀(Synergy H4 Hybrid Reader)、HPLC (Prominence LC-20AT)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

孢子培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 (g/L)：黃豆粉20，甘露醇20，Agar 20，121 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基為R2YE培養(yǎng)基 (g/L)：蔗糖103，K2SO40.25，MgCl210.12，葡萄糖10，酸水解酪素0.1，酵母提取物 5，微量元素 (ZnCl20.04，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.2，CuCl2·2H2O 0.01，MnCl2·4H2O 0.01，Na2B4O7·10H2O 0.01，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.01) 2 mL，蒸餾水800 mL，滅菌后加入KH2PO41 mL, CaCl2·2H2O 8 mL，L-proline 10 mL，NaOH 0.5 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件

將凍存于–80 ℃的孢子劃線接種于MS培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)4 d，收集新鮮孢子接種于R2YE培養(yǎng)基中，接種濃度為4×108個(gè)孢子/100 mL培養(yǎng)基，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)6 d。

1.3 樣品制備方法

取樣后，將 1 mL菌液迅速離心 (4 ℃、13 000×g) 10 min，保留上清，用于測(cè)定放線紫紅素的產(chǎn)量，收集的菌體用于測(cè)定十一烷基靈菌紅素的產(chǎn)量。其余樣品迅速低溫淬滅后，用于制備胞內(nèi)代謝物樣品。

1.3.1 細(xì)胞淬滅

將細(xì)胞培養(yǎng)物按1：4的比例迅速加入60%(V/V) 甲醇/水溶液中 (–40 ℃預(yù)冷 24 h)，搖勻后于–40 ℃靜置 (按需要分別靜置 2、4、6、8和 10 min)。

1.3.2 菌體分離

采用離心與快速過濾兩種方法分離菌體。1) 離心法：將細(xì)胞淬滅物進(jìn)行冷凍離心，(–9 ℃，2 000×g，3 min)，棄上清并用 0 ℃預(yù)冷的去離子水洗滌菌體，重復(fù) 3次，最后一次離心條件為–9 ℃，8 000×g，5 min。2) 快速過濾法：利用真空泵對(duì)細(xì)胞淬滅物進(jìn)行快速過濾并用0 ℃預(yù)冷的去離子水洗滌菌體 (1 min內(nèi)完成所有步驟)。將兩種方法得到的菌體凍存于–80 ℃。

1.3.3 代謝物提取與濃縮

將收集的菌體利用液氮研磨，收集300 mg粉末于2 mL離心管中，加入1 mL 50% (V/V) 甲醇/水溶液 (–40 ℃預(yù)冷24 h)，劇烈振蕩后迅速投入液氮中速凍，設(shè)置速凍時(shí)間分別為 45 s、3 min和5 min，之后于冰上融化，重復(fù)3次。然后將混合物低溫離心 (–9 ℃，13 000×g，5 min)，取800 μL上清至15 mL離心管中。再向2 mL離心管中加入500 μL預(yù)冷的50% (V/V)甲醇/水溶液，劇烈振蕩后以相同的條件離心，再將500 μL上清轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，并加入20 μL 0.2 mg/mL D4-琥珀酸作為內(nèi)標(biāo)。將抽提的代謝物溶液于–80 ℃過夜冷凍后，凍干24 h。

1.3.4 代謝物衍生化

將凍干樣品加入 50 μL甲氧胺鹽吡啶溶液(20 mg/mL)，于水浴中加熱 90 min (37 ℃或40 ℃)；之后加入 80 μL MSTFA 繼續(xù)加熱90 min (37 ℃[15]或 40 ℃[16])，得到 GC-MS 分析樣品。

1.4 GC-MS代謝物檢測(cè)方法

色譜條件為：氣相色譜分析儀Agilent 7890A，色譜柱 DB-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent)；柱溫箱升溫程序70 ℃保持2 min，然后以5 /min℃升溫至290 ℃并保持3 min；進(jìn)樣口及檢測(cè)器溫度均保持為250 ℃；GC-MS接口溫度為280 ℃；載氣為He氣，流速1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量為1 μL，分流比為20：1。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀 Aglient 5975C MSD System；電子轟擊電離 (EI+源)，EI+源溫度 250 ℃，轟擊能量eV，離子電流40 μA；掃描分子量范圍25–650；掃描速度2 scan/second。

1.5 其他分析方法

1.5.1 采用二苯胺法[17]確定生物量

收集1 mL發(fā)酵液，離心去上清后用SET 緩沖液洗1次，離心去上清；將菌體重懸于2 mL二苯胺試劑中，60 ℃水浴1 h，之后離心取上清測(cè)定OD595。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5.2 放線紫紅素產(chǎn)量測(cè)定方法

收集1 mL發(fā)酵液，4 ℃、10 000×g離心取上清，加入終濃度1 mol/L的KOH，離心取上清，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD640。根據(jù)該波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù) (ε640=25 320) 計(jì)算 Act產(chǎn)量[18]。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5.3 十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量測(cè)定

收集1 mL發(fā)酵液，4 ℃、10 000×g離心收集菌體，1 mol/L HCl洗滌菌體2次，1 mL甲醇萃取，離心取上清，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD530，根據(jù)該波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù) (ε530=100 500) 計(jì)算Red產(chǎn)量[19]。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理方法

代謝物數(shù)據(jù)的相對(duì)定量是根據(jù)總離子流峰進(jìn)行的。代謝物組分的獲得方法是將由 Agilent 7890/5975C MSD System采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入解卷積軟件AMDIS中分析得到。將解卷積后的數(shù)據(jù)與NIST 8.0庫(kù)、Fiehn代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)搜索得到相應(yīng)的代謝物 (檢索匹配度要求高于 80)。進(jìn)一步結(jié)合 METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)和 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝物所屬途徑進(jìn)行分類。將質(zhì)譜峰面積分別對(duì)各樣品的生物量和內(nèi)標(biāo)物的峰面積進(jìn)行歸一化，獲得胞內(nèi)代謝物的相對(duì)濃度。每個(gè)樣品設(shè)置 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別選擇對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的胞內(nèi)代謝物樣品中檢測(cè)到的部分代謝物，以及胞外Act產(chǎn)量為例，利用t-test檢驗(yàn)樣品間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 樣品數(shù)據(jù)的重復(fù)性檢測(cè)

為了獲得精確的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)初始首先對(duì)GC-MS儀器檢測(cè)的重復(fù)性進(jìn)行了考察。以內(nèi)標(biāo)物D4-琥珀酸為例，分別進(jìn)樣3次，其出峰時(shí)間分別為16.160、16.162和16.171 min，這個(gè)結(jié)果表明儀器的重復(fù)性很好。

為了檢驗(yàn)不同生物學(xué)樣品的重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)取24 h和72 h的3個(gè)樣品所采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。將胞內(nèi)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后，隨機(jī)抽取不同胞代謝物的總離子流質(zhì)譜峰面積，以及胞外代謝產(chǎn)物 Act的濃度。如表 1所示，3個(gè)生物學(xué)樣品的P-value均大于0.1，表明樣本間的差異不顯著，所取的 3個(gè)生物學(xué)樣品的重復(fù)性良好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 不同樣品處理?xiàng)l件對(duì)代謝物提取的影響

2.2.1 細(xì)胞淬滅時(shí)間優(yōu)化

細(xì)胞淬滅能夠及時(shí)終止胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，是獲得能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞瞬時(shí)生理狀態(tài)的代謝物樣品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究以冷甲醇水為淬滅溶劑，著重研究了淬滅時(shí)間對(duì)代謝物提取的影響。迅速?gòu)耐慌囵B(yǎng)瓶中取5份天藍(lán)色鏈霉菌M145的對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物 (30 h)，并同時(shí)分別與–40 ℃預(yù)冷的 60% (V/V) 甲醇水按 1：4體積混合，置于–40 ℃分別靜置 2、4、6、8和10 min，然后提取代謝物后進(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果如圖2所示，淬滅時(shí)間為2 min時(shí)，提取到的代謝物組分?jǐn)?shù)為 (272±13)，當(dāng)淬滅時(shí)間延長(zhǎng)至4 min時(shí)，提取到的代謝物組分?jǐn)?shù)目最多，達(dá)到356個(gè)。然而繼續(xù)延長(zhǎng)淬滅時(shí)間代謝物組分?jǐn)?shù)則會(huì)顯著下降，10 min時(shí)僅有 (110±8) 個(gè)，較4 min時(shí)降低69.1%。此外，如圖2所示，將總離子流 (TIC) 峰面積設(shè)置為105時(shí)，淬滅4 min時(shí)所獲得的代謝物TIC峰面積大于該值的代謝物數(shù)目分別較其他 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)多 46%(2 min)、29% (6 min)、68% (8 min) 和 89%(10 min)。這些數(shù)據(jù)表明4 min是天藍(lán)色鏈霉菌淬滅效果最好的時(shí)間段。

2.2.2 細(xì)胞分離條件優(yōu)化

快速干凈地分離菌體與淬滅液和胞外代謝物的混合物，能夠減少胞內(nèi)代謝物損失和外界雜質(zhì)干擾。對(duì)比低溫離心與快速抽濾兩種方法，結(jié)果顯示針對(duì)同一天藍(lán)色鏈霉菌M145樣品，快速抽濾可得到 (373±9) 個(gè)組分峰，較低溫離心法提取的組分峰數(shù)目 (312±12) 高 19.6%。此外，抽濾法得到的TIC峰面積大于105的代謝物數(shù)目較低溫離心法高65%。

表1 樣品生物學(xué)重復(fù)檢驗(yàn)Table 1 Significance test of different biological samples

圖2 不同淬滅時(shí)間對(duì)代謝物提取的影響Fig. 2 Impact of quenching times on the extration of metabolites. QT: quenching time; CN: number of metabolite components; TIC: total ion chromatogram.

圖3 不同菌體分離方式對(duì)代謝物提取的影響Fig. 3 Impact of different cell separation methods on metabolite extraction after quenching. TIC: total ion chromatogram.

2.2.3 代謝物提取條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了天藍(lán)色鏈霉菌代謝物提取條件。為了使代謝物充分釋放，采用液氮研磨的方式對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，利用–40 ℃預(yù)冷的50% (V/V) 甲醇水多次抽提及液氮-冰水反復(fù)凍融提取代謝物。實(shí)驗(yàn)比較了不同的液氮速凍時(shí)間(45 s、3 min和5 min) 對(duì)代謝物提取的影響，結(jié)果表明45 s的速凍時(shí)間能夠檢測(cè)到 (464±17) 種代謝物組分，而延長(zhǎng)速凍時(shí)間至3 min和5 min則會(huì)導(dǎo)致代謝物組分分別較45 s減少24.8%和28.7%。此外，45 s液氮速凍時(shí)間獲得的代謝物中，TIC峰面積大于105的數(shù)目較其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別高27%和59%。這些結(jié)果表明在液氮中速凍45 s而后在冰上融化是反復(fù)凍融的較好條件。

2.2.4 代謝物衍生化條件的優(yōu)化

提取獲得胞內(nèi)代謝物后，衍生化過程能夠增加代謝物的穩(wěn)定性并降低其沸點(diǎn)，有利于GC-MS檢測(cè)胞內(nèi)代謝物。本工作比較了37 ℃和40 ℃兩個(gè)溫度條件下衍生化試劑的衍生效率，結(jié)果顯示，37 ℃處理代謝物分別與甲氧胺鹽和MSTFA反應(yīng)90 min，仍有13.7%的代謝物僅被部分衍生化。而在40 ℃處理下，試劑的衍生化效率可達(dá)到96.7%。

2.3 GC-MS可檢測(cè)代謝物在天藍(lán)色鏈霉菌代謝網(wǎng)絡(luò)中的覆蓋度

圖4 不同液氮速凍時(shí)間對(duì)代謝提取的影響Fig. 4 Impact of the different freeze-thaw times in liquid nitrogen on metabolite extration. TIC: total ion chromatogram.

表2 GC-MS檢測(cè)到的胞內(nèi)代謝物Table 2 Intracellular metabolites identified by GC-MS

續(xù)表2

本工作對(duì)利用上述優(yōu)化條件制備的代謝物樣品進(jìn)行了 GC-MS檢測(cè)，結(jié)果如表 2所示。在能夠檢測(cè)到的400多個(gè)組分峰中，通過與 NIST、METLIN、Fiehn代謝物譜庫(kù)以及分析，能夠精確匹配糖酵解、戊糖磷酸途徑、檸檬酸循環(huán)、氨基酸、脂肪酸及脂類、肌醇代謝、核酸代謝、糖苷類代謝、輔因子、甾醇、激素和萜類等代謝途徑中的103個(gè)代謝物。

在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌的代謝物組學(xué)研究中，一般能夠檢測(cè)到覆蓋以上代謝途徑的80–100個(gè)代謝物即能滿足比較代謝物組學(xué)分析的要求[6-20]。因此我們認(rèn)為利用我們建立的研究方法以及現(xiàn)有的質(zhì)譜平臺(tái)，也能夠滿足鏈霉菌代謝物組學(xué)相關(guān)研究。

2.4 天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞代謝的時(shí)序分析

建立了鏈霉菌代謝物組學(xué)研究方法后，為了解析鏈霉菌初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的關(guān)聯(lián)，我們對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌不同生長(zhǎng)階段部分代謝途徑的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了分析。首先，在R2YE液體培養(yǎng)基中測(cè)定了天藍(lán)色鏈霉菌的生長(zhǎng)曲線和次級(jí)代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素和放線紫紅素的產(chǎn)生曲線 (圖 5)?？梢钥闯觯?dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，次級(jí)代謝產(chǎn)物十一烷基靈菌紅素才開始產(chǎn)生 (約48 h)，而放線紫紅素的產(chǎn)生時(shí)間更滯后 (約72 h)。于是，根據(jù)前面建立的分析方法，選取對(duì)數(shù)前期 (18 h) 、對(duì)數(shù)期 (30 h)、穩(wěn)定前期 (48 h) 和穩(wěn)定后期 (72 h) 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析該菌株的代謝時(shí)序差異。結(jié)果如圖6所示，可以發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑 (PPP)和三羧酸循環(huán) (TCA) 在對(duì)數(shù)期有相對(duì)較高的代謝強(qiáng)度，而在次級(jí)代謝生物合成的穩(wěn)定期(72 h)，這些途徑急劇減弱，可檢測(cè)到的代謝物相對(duì)濃度僅有對(duì)數(shù)期 (30 h) 的 1%–16%；而可檢測(cè)到的一些氨基酸相對(duì)于糖酵解途徑和 TCA循環(huán)下降趨勢(shì)較緩；與以上途徑的相對(duì)強(qiáng)度趨勢(shì)顯著不同，相對(duì)于對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定后期，一些脂肪酸不僅在穩(wěn)定前期濃度相對(duì)較高，而且在穩(wěn)定后期的下降也相對(duì)緩慢，72 h代謝物濃度仍可達(dá)到30 h的63%–77%。這些結(jié)果表明，在鏈霉菌中部分氨基酸途徑和脂肪酸途徑可能充當(dāng)了初級(jí)代謝和次級(jí)代謝轉(zhuǎn)換的橋梁。

圖5 天藍(lán)色鏈霉菌M145生長(zhǎng)曲線、放線紫紅素和十一烷基靈菌紅素合成曲線Fig. 5 Growth curve (■) , and production curves of undecylprodigiosin (▲), actinhordin (●) of S. coelicolor M145.

圖6 天藍(lán)色鏈霉菌M145主要胞內(nèi)代謝物的時(shí)序變化特征Fig. 6 Temporal profiles of different metabolites in S. coelicolor M145.

3 討論

鏈霉菌作為抗生素的重要工業(yè)產(chǎn)生菌，其代謝工程改造提高抗生素產(chǎn)量具有重要意義。在工程菌改造過程中，代謝物組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究手段，在目的產(chǎn)物相關(guān)代謝物的發(fā)現(xiàn)中具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。為了方便代謝物組學(xué)在鏈霉菌研究中的應(yīng)用，本文對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組學(xué)樣品制備方法進(jìn)行了一些摸索。由于鏈霉菌與其他細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同，會(huì)在液體培養(yǎng)基中形成菌絲團(tuán)。這要求我們?cè)谥苽錅?zhǔn)確反映細(xì)胞瞬時(shí)生理狀態(tài)的代謝物時(shí)，不能采取和大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等相同的方法，所以本文主要對(duì)鏈霉菌代謝物樣品制備步驟進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

細(xì)胞淬滅能夠及時(shí)終止胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，是獲得能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞瞬時(shí)生理狀態(tài)的代謝物樣品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有研究比較了各種淬滅溶劑對(duì)不同菌株代謝物提取的影響，并證明冷甲醇水對(duì)多種菌株具有較好的淬滅效果[13-21]。目前有關(guān)鏈霉菌代謝物組學(xué)的研究也多采用冷甲醇水為細(xì)胞淬滅劑[22-23]。由于淬滅劑會(huì)對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞作用，因此嚴(yán)格控制淬滅時(shí)間防止導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物滲漏非常重要。然而目前并無(wú)相關(guān)研究考察以冷甲醇水為淬滅溶劑時(shí)，淬滅時(shí)間對(duì)鏈霉菌代謝物提取的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，冷甲醇水的低溫 (–40 ℃) 淬滅時(shí)間維持在 4 min時(shí)能夠較好地保證及時(shí)終止鏈霉菌胞內(nèi)的代謝活動(dòng)，獲得較多的代謝物。淬滅時(shí)間較短不能充分終止反應(yīng)，而時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，由于細(xì)胞壁受損嚴(yán)重導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物大量滲漏，致使獲得的代謝物數(shù)目顯著降低 (圖 2)。此外，通過比較不同的菌體分離方法，發(fā)現(xiàn)快速抽濾法提取得到的代謝物質(zhì)量?jī)?yōu)于離心分離法，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有以下兩點(diǎn)：一，在離心過程中，細(xì)胞與淬滅溶劑接觸時(shí)間較長(zhǎng)，胞內(nèi)代謝物與溶劑充分交換，導(dǎo)致大量滲漏；二，淬滅后的細(xì)胞壁非常脆弱，離心和洗滌過程產(chǎn)生的剪切力引發(fā)菌絲斷裂，造成代謝物滲漏。相對(duì)而言，快速過濾時(shí)間短暫，可以避免胞內(nèi)代謝物向溶劑大量擴(kuò)散，此外該方法還可以避免剪切力對(duì)細(xì)胞損傷，減少代謝物滲漏。液氮反復(fù)凍融是提取胞內(nèi)代謝物的主要方法[23-24]，然而，對(duì)于具有較厚細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌，反復(fù)凍融法通常不能充分提取胞內(nèi)代謝物[8]。為了解決這一問題，我們采取了液氮研磨加反復(fù)凍融的提取方法。此外，研究還發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融的過程中較長(zhǎng)的液氮速凍時(shí)間反而不利于代謝物的獲得，這一現(xiàn)象的原因仍不確定。最后研究了溫度對(duì)代謝物衍生率的影響，發(fā)現(xiàn)40 ℃條件下衍生化效率較37 ℃高。通過對(duì)各樣品制備環(huán)節(jié)進(jìn)行比較優(yōu)化，最終得到最適合天藍(lán)色鏈霉菌代謝物分析樣品的制備方法。

通過我們建立的方法成功得到 400多個(gè)天藍(lán)色鏈霉菌代謝物組分后，利用已有的NIST、MTEALIN和Fiehn代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，參考相關(guān)文獻(xiàn)并與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中該菌株的代謝途徑相匹配，確定出 103個(gè)能與代謝途徑精確匹配的代謝物。目前并無(wú)針對(duì)鏈霉菌胞內(nèi)代謝物樣品制備方法的詳細(xì)研究，而利用現(xiàn)有的文獻(xiàn)方法制備的代謝物樣品，組分也主要集中于氨基酸及其衍生物和部分脂肪酸及脂類[23-25]，少于本文方法所獲得的組分種類。此外，其他未確定組分主要可分為兩部分，一部分是與譜庫(kù)中匹配度較低，只根據(jù)代謝物的精確質(zhì)量數(shù)并不能定性；另一部分是天藍(lán)色鏈霉菌的代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)中并未收集該化合物信息。鏈霉菌不同于其他細(xì)菌，除了初級(jí)代謝，還存在大量的次級(jí)代謝基因簇，例如天藍(lán)色鏈霉菌有23個(gè)次級(jí)代謝基因簇，這些基因簇的編碼產(chǎn)物以及中間代謝物上沒有相關(guān)的精確質(zhì)譜信息，因此在鏈霉菌代謝物組學(xué)研究中，代謝物的精確匹配、歸屬仍存在較大挑戰(zhàn)。

利用建立的鏈霉菌代謝物組學(xué)樣品制備方法，我們對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌各個(gè)代謝途徑在不同生長(zhǎng)階段的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行了分析，在代謝物層面上發(fā)現(xiàn)了鏈霉菌初級(jí)代謝相關(guān)途徑 (糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)) 和次級(jí)代謝的生物合成存在明顯的時(shí)間差。而介于此時(shí)間差之間的是一些氨基酸和脂類物質(zhì)的代謝物處于較高水平，所以我們推測(cè)可能是一些氨基酸和脂類相關(guān)途徑在鏈霉菌生長(zhǎng)周期中承擔(dān)了銜接初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的角色。

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