5-氮雜胞苷對(duì)石斛生物活性成分的影響

倪竹君，殷麗麗，應(yīng)奇才，茹雅璐，王迪仙，金 琳，謝 軍，胡忠建，王慧中，徐祥彬

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

5-氮雜胞苷對(duì)石斛生物活性成分的影響

倪竹君，殷麗麗，應(yīng)奇才，茹雅璐，王迪仙，金 琳，謝 軍，胡忠建，王慧中，徐祥彬*

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036）

本研究利用5-氮雜胞苷（5-azaC）處理石斛組培苗，分析石斛苗生長(zhǎng)變化、生物活性物質(zhì)含量及其相關(guān)基因表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)，石斛苗生物量和生物活性物質(zhì)，如石斛多糖、石斛堿和胡蘿卜素，含量明顯升高，相關(guān)基因表達(dá)量也顯著上升，證實(shí)DNA去甲基化修飾對(duì)石斛次生代謝產(chǎn)物生物合成具有重要調(diào)控作用。

5-氮雜胞苷；DNA去甲基化修飾；石斛；生物活性成分

浙江省是中國(guó)最早實(shí)現(xiàn)石斛產(chǎn)業(yè)化的省份，是石斛類保健產(chǎn)品的生產(chǎn)基地和消費(fèi)大省。目前，全省鐵皮石斛類藥品和保健食品的年銷售規(guī)模近10億元，拉動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值幾十億元，已形成集科研、種植、加工、銷售為一體的石斛產(chǎn)業(yè)。但與野生條件生長(zhǎng)的石斛相比，目前人工栽培的石斛藥材活性成分含量較少，極大影響了石斛藥用，盡管有研究人員采用“仿野生栽培”方式培養(yǎng)，但仍不能從根本上解決石斛活性成分積累的問題。隨著DNA甲基化和去甲基化修飾在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆過程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究，以及在微生物活性成分積累上的大量研究應(yīng)用，越來越多的證據(jù)表明，DNA甲基化和去甲基化修飾在調(diào)控藥用植物活性成分含量方面具有重要的應(yīng)用前景。因此，篩選能夠調(diào)控石斛生物活性物質(zhì)成分合成積累的DNA甲基酶抑制劑小分子，研發(fā)生物化學(xué)和分子生物學(xué)定向調(diào)控技術(shù)，提高石斛藥用和食用價(jià)值，對(duì)浙江省石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和廣闊的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5-azaC（Sigma）先溶于10μL二甲基亞砜，后溶于水，配成10，20和50μmol·L-1溶液備用。

金釵石斛產(chǎn)自云南，無菌組培苗由其種子播種在N6培養(yǎng)基上分化，使用B5培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)獲得。用20μmol·L-15-氮雜胞苷處理120d組培苗，然后置于溫室中分別培養(yǎng)0，60和90d，用天平測(cè)量生物量變化，并取液氮速凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物活性物質(zhì)含量測(cè)定

1.2.1 可溶性多糖測(cè)定

稱取80℃烘干的石斛粉末0.5g，置于圓底燒瓶中，加入石油醚50mL，65℃回流提取1h，脫脂，過濾，揮干溶劑，加入80%乙醇50mL，回流提取1 h，過濾，揮干溶劑，加入蒸餾水20mL于80℃回流提取2h，趁熱過濾，取濾液滴在Pocket-Refractometer Pal-1型糖度計(jì)上測(cè)定可溶性多糖含量。

1.2.2 石斛堿測(cè)定

將金釵石斛于80℃烘干至恒重，粉碎后精密稱取0.5g，置100mL圓底燒瓶中，加2mL氨水潤(rùn)濕30min后，加入氯仿50mL，稱重，65℃回流提取2 h，以氯仿補(bǔ)足失重，減壓回收溶劑至干，加甲醇超聲溶解，定量轉(zhuǎn)入2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸入注射器，0.45μm微孔濾膜過濾，注入進(jìn)樣瓶。利用氣相色譜（GC）測(cè)定，毛細(xì)管柱，19091J-413HP-530.0m×320μm×0.25μm，氮?dú)廨d入，流速0.7mL·min-1，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫以5℃·min-1的速度從120℃升至150℃（起始溫度點(diǎn)和終止溫度點(diǎn)均穩(wěn)定15min），氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)器溫度為250℃。

1.3引物合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）

參照本實(shí)驗(yàn)室EST測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)Actin引物：Forward：5’-AGGCTAACAGAGAGAAGA TG-3’和Reverse：5’-AGCAAGGTCAAGCCT CAGAAT-3’；托品酮還原酶基因（TRⅡ）：Reverse：5’-GGATAGGGTATGCCATTGTTG-3’和Reverse：5’-GCCATCTTTACCCCATTC AC-3’；3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（HMGR）Forward：5’-TGCTTACAAAATGAC TTCCCTG-3’和Reverse：5’-CCCTTTACGCCA AGCAGAT-3’。

Real-TimePCR反應(yīng)體系均為2×qPCRMix25 μL，PCR引物各25pmol，cDNA模板1μL（約200ng），Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50μL。反應(yīng)步驟為：95℃預(yù)變性5min；95℃15s，52℃30s，循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性多糖含量變化

由表1可知，5-azaC處理60和90d后，石斛可溶性多糖含量明顯上升，每克干重材料分別達(dá)到0.1311和0.1645g，分別是對(duì)照的1.1和1.2倍。說明5-azaC處理確實(shí)影響了多糖生物合成過程，提高了其含量。

表1 5-azaC處理后石斛多糖含量變化

2.2 石斛堿含量變化

5-azaC處理以后，石斛堿含量顯著上升。處理60和90d后，石斛堿含量在每克干重材料分別達(dá)到了0.1722和0.1764g，分別是對(duì)照的1.5和1.6倍，說明5-azaC處理影響了石斛堿生物合成過程。

表2 5-azaC處理后石斛堿含量變化

2.3 生物活性物質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量變化

通過Real-TimePCR可知，5-azaC處理60和90d后，TRⅡ基因相對(duì)表達(dá)量顯著上升（圖1）。由于TRⅡ基因編碼生物堿合成酶托品酮還原酶，其表達(dá)量升高可提高生物堿生物合成量，這可能與5-azaC處理激活相關(guān)隱性基因表達(dá)有關(guān)。

圖1 TRⅡ基因相對(duì)表達(dá)量分析

由圖2可知，在5-azaC處理后，組培石斛苗HMGR基因相對(duì)表達(dá)量也顯著上升。處理60和90 d后，雖然對(duì)照石斛中該基因表達(dá)也有上調(diào)，但上調(diào)幅度不如5-azaC處理高。由于HMGR基因編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，是生物堿骨架結(jié)構(gòu)生物合成的關(guān)鍵酶，因此該基因的表達(dá)對(duì)生物堿含量正調(diào)控具有重要作用。

圖2 HMGR基因相對(duì)表達(dá)量分析

3 小結(jié)與討論

作為表觀遺傳學(xué)一種主要機(jī)制，DNA甲基化和去甲基化修飾在植物生長(zhǎng)、發(fā)育、開花、衰老及抗逆過程中扮演著重要的角色，是調(diào)節(jié)基因功能的重要手段。在相對(duì)穩(wěn)定的基因組內(nèi)，DNA甲基化能夠確保基因組的正常協(xié)調(diào)表達(dá)，一旦這種正常的DNA甲基化體系遭到破壞，就會(huì)出現(xiàn)異?；虮磉_(dá)現(xiàn)象，進(jìn)而影響其表現(xiàn)［1-6］。在微生物中，DNA的去甲基化對(duì)于沉默基因的轉(zhuǎn)錄重激活也起著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化可激活真菌部分沉默基因表達(dá)，調(diào)控次級(jí)代謝反應(yīng)，從而提高活性物質(zhì)合成。例如利用5-azaC能激活裂褶菌和粗糙脈胞菌中的潮霉素抗性基因，以及黃孢原毛平革菌中的腐草霉素抗性基因［7-8］。Mooibroek等［7］先后使用5種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，分別對(duì)12種真菌進(jìn)行表觀遺傳修飾，發(fā)現(xiàn)11種真菌次級(jí)代謝發(fā)生明顯變化，活性物質(zhì)產(chǎn)量明顯提高，其中膠孢殼屬產(chǎn)生了2種新型糖基化聚酮化合物。說明DNA去甲基化修飾對(duì)微生物生物活性物質(zhì)具有重要調(diào)控作用。

從試驗(yàn)結(jié)果可知，5-azaC處理金釵石斛組培苗后，其多糖含量和生物堿含量明顯上升，編碼生物堿合成酶托品酮還原酶的TRⅡ基因和編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶HMGR基因相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，說明5-azaC去甲基化修飾處理可能激活了這些生物堿合成相關(guān)基因表達(dá)，從而提高石斛藥用價(jià)值。由于石斛遺傳背景還不清楚，沒有相關(guān)基因組數(shù)據(jù)庫信息，目前還不能進(jìn)一步驗(yàn)證5-azaC處理對(duì)石斛基因組去甲基化修飾的具體位點(diǎn)，但通過本研究及微生物研究已有結(jié)果可知，DNA去甲基化修飾對(duì)提高石斛藥用價(jià)值具有很大的潛在應(yīng)用性。因此進(jìn)一步篩選能夠調(diào)控石斛生物活性物質(zhì)成分合成積累的DNA甲基酶抑制劑小分子，研發(fā)生物化學(xué)和分子生物學(xué)定向調(diào)控技術(shù)，對(duì)提高石斛藥用和食用價(jià)值，促進(jìn)浙江省石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民增收具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S432.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0528-9017（2014）07-1018-03

文獻(xiàn)著錄格式：倪竹君，殷麗麗，應(yīng)奇才，等.5-氮雜胞苷對(duì)石斛生物活性成分的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（7）：1018-1020.

2014-04-10

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20120232B11）

倪竹君（1991-），女，生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院本科生。E-mail：441845349@qq.com。

徐祥彬（1977-），男，副教授，博士，從事植物表觀遺傳學(xué)研究工作。E-mail：xbxuibcas@126.com。