自制單硝酸異山梨酯緩釋膠囊的體外釋放度考察

馬亞中，吳 燕，郭雙艷（空軍總醫(yī)院藥學部，北京 100142）

單硝酸異山梨酯是硝酸異山梨酯的主要活性代謝物[1]，其可通過擴張外周血管、減少心肌耗氧量從而緩解或消除心絞痛[2]，臨床用于冠心病的長期治療、血管痙攣型和混合型心絞痛的預(yù)防[3-4]。目前，國內(nèi)雖有很多廠家生產(chǎn)單硝酸異山梨酯緩釋膠囊，但質(zhì)量差別較大，緩釋效果較不理想，取樣時間點分別有不同程度的突釋現(xiàn)象，容易產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，筆者研制了單硝酸異山梨酯緩釋膠囊。為了考察該制劑的生產(chǎn)工藝，保證不同批號產(chǎn)品之間的質(zhì)量穩(wěn)定性，筆者建立了考察該制劑體外釋放度的方法[5-7]。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括四元泵、VWD檢測器（美國Aglient公司）；ZRS-8G溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

單硝酸異山梨酯標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100694-200401，純度：99.9%）；單硝酸異山梨酯緩釋膠囊（自制品，批號：20121003、20121004、20 121005；對照品，珠海許瓦茲制藥有限公司，批號：611001；規(guī)格：均為每粒60 mg）；甲醇為色譜純；水為自制；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（37 ∶63），流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；進樣量：20μl；柱溫：25 ℃。溶劑：混合流動相。理論板數(shù)按單硝酸異山梨酯峰計不低于5 000。取“2.2”項下標準品溶液、供試品溶液、空白溶劑（即流動相）及空白輔料溶液進樣分析，色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取減壓干燥后的單硝酸異山梨酯標準品適量，加水溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度為100μg/ml的溶液，作為標準品溶液。取樣品細粉適量（約含主藥50 mg），至50 ml 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml置于10 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液。按處方量稱取本品輔料，按供試品溶液制備方法制備成空白輔料溶液。

2.3 標準曲線的制備

精密稱取經(jīng)減壓干燥后的單硝酸山梨酯標準品50 mg，置于50 ml 量瓶中，加水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mg/ml溶液；分別精密量取該溶液1、2、3、4、5、6、7 ml，分別置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成相當于檢測質(zhì)量濃度20%、40%、60%、80%、100%、120%、140%的溶液，配成20～140 μg/ml 的線性質(zhì)量濃度，注入色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得線性方程為：A＝9.258 5c+9.077 8（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，單硝酸異山梨酯檢測質(zhì)量濃度線性范圍為20～140μg/ml。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.空白輔料溶液；C.標準品溶液；D.供試品溶液（批號：20121003）；1.單硝酸異山梨酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.blank excipients solution；C.standard solution；D.test solution（lot No.20121003）；1.isosorbide mononitrate

2.4 回收率試驗

按處方量稱取輔料，分別加入單硝酸異山梨酯標準品，相當于處方量的80%、100%、120%，混合均勻，置于50 ml量瓶中，加水適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾；分別精密量取續(xù)濾液1 ml至10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取單硝酸異山梨酯標準品約50 mg 置于50 ml量瓶中，用水適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取1 ml至10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。依法測定含量并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2”項下100μg/ml的標準品溶液20μl，重復(fù)進樣6次，結(jié)果單硝酸異山梨酯峰面積的RSD＝0.47%（n＝6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下供試品溶液在室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣20 μl，測定。結(jié)果單硝酸異山梨酯峰面積的RSD＝0.75%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 釋放度測定

3.1 釋放介質(zhì)的選擇

考慮患者年齡、體質(zhì)、身體狀況等的不同，本試驗采用2010年版《中國藥典》方法[8]及“日本藥品品質(zhì)再評價工程”中推薦使用的4種溶劑（水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.0醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液）為釋放介質(zhì)（其在后3種介質(zhì)中的線性方程分別為A＝9.617 5c+4.514 3、A＝9.842 3c－13.329 0、A＝10.021c－24.634，r分別為0.999 9、0.999 5、0.999 9）。分別于1、4、8 h取樣（批號：20121003）10 ml，過濾，同時補充等溫同體積的釋放介質(zhì)；取續(xù)濾液20 μl，測定，計算累積釋放度（%），結(jié)果見圖2。

圖2 單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在4 種介質(zhì)中的累積釋放度比較Fig 2 Comparison of accumulative release rate of Isosorbide mononitrate sustained-release capsules in 4 mediums

由圖2可知，單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在4種釋放介質(zhì)中的釋放行為沒有明顯差異。以簡單方便為原則，選擇水為釋放介質(zhì)。

3.2 釋放度測定方法的選擇

本品為膠囊，采用槳法時膠囊會漂浮在液面上，故參照2010年版《中國藥典》溶出度測定法第一法（籃法）[8]進行測定。

3.3 轉(zhuǎn)速的選擇

以水為釋放介質(zhì)進行本品的釋放度測定，轉(zhuǎn)速分別選擇50、75、100 r/min，其累積釋放度結(jié)果見圖3。

圖3 單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在不同轉(zhuǎn)速下的累積釋放度比較Fig 3 Comparison of accumulative release rate of Isosorbide mononitrate sustained-release capsules at different rotation speeds

由圖3可知，采用以上3種轉(zhuǎn)速，釋放度無明顯差別，藥物均可釋放完全。綜合考慮以上結(jié)果，確定本品釋放試驗轉(zhuǎn)速為50 r/min。

3.4 釋放度均一性及重現(xiàn)性試驗

取3批樣品各6粒，采用籃法，以水500 ml為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，水溫（37.5±0.5）℃，分別放入釋放杯中，于1、4、8 h時取樣10 ml（同時補充等溫同體積的釋放介質(zhì)），濾過，作為供試品溶液；另取單硝酸異山梨酯標準品適量，制備成100μg/ml 的標準品溶液，計算各樣品在不同時間點的累積釋放度，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，3批樣品在8 h時累積溶出度均大于80%，各取樣點RSD 均小于2%（n＝6），表明釋放度均一性和重現(xiàn)性良好。

圖4 3批樣品釋放度均一性和重現(xiàn)性考察結(jié)果Fig 4 Uniformity and reproducibility of release rate for 3 batches of samples

3.5 相似因子（f2）法評價釋放曲線

取單硝酸異山梨酯緩釋膠囊自制品與對照品進行釋放度考察，其釋放曲線見圖5。

圖5 自制品與對照品釋放度比較Fig 5 Comparison of release rate of self-made preparation with reference preparation

采用f2法對兩條藥物體外釋放曲線進行評價，計算公式[9]為：

式中，Rt和Tt分別為各取樣時間點自制品與對照品的平均釋放度，n為取樣時間點個數(shù)。如果50≤f2≤100，表示兩者相似，在此范圍內(nèi)，f2越大表示越相似。計算得自制品和對照品釋放曲線的f2為85.37，可認為兩者釋放度相似。

3.6 釋放模型擬合

分別取自制品和對照品按照“3.4”項下釋放度測定方法，依法操作，并分別采用一級方程、Higuchi方程及Weibull[10-11]模型對二者的體外釋放數(shù)據(jù)即累積釋放度（Q）-時間（t）進行擬合，結(jié)果見表2。

表2 釋放模型擬合結(jié)果Tab 2 Results of release model fitting

將兩種制劑分別用不同釋放模型進行擬合，結(jié)果表明兩種制劑的體外釋放行為最符合Higuchi方程。

4 討論

4.1 波長的選擇[12-13]

本試驗最初采用紫外分光光度法測定單硝酸異山梨酯緩釋膠囊的含量，但空白輔料在主藥的最大吸收波長處有紫外吸收，而且供試液自身的吸收度值偏低，輔料對其測定有一定的影響。為使測定結(jié)果準確，故建立了專屬性更強的高效液相色譜法進行測定。在選擇測定波長時，最初參考相關(guān)文獻[14]選用210 nm，但此波長處甲醇的干擾峰較大，為了避免甲醇的末端吸收，最終選擇測定波長為220 nm。

4.2 取樣時間點的選擇

本試驗取樣點的選擇參考國外進口標準[珠海許瓦茲WS1-（X-116）-2006Z][15]，分別為1、4、8 h 3個取樣點。1 h取樣點用于考察藥物是否有突釋現(xiàn)象，其應(yīng)在38%～50%；4 h 取樣點用于考察釋藥物是否平穩(wěn)釋放，應(yīng)在50%～70%；8 h 取樣點用于考察藥物釋放是否基本完全，釋放度應(yīng)為75%以上。試驗最初還選擇了12 h的取樣點，但結(jié)果證明與8 h累積釋放度無太大差別，故最終確定取樣時間點為1、4、8 h。

4.3 對自制品的評價

通過對自制單硝酸異山梨酯緩釋膠囊在不同介質(zhì)及轉(zhuǎn)速條件下的釋放度比較，發(fā)現(xiàn)其在各種釋放條件下差異微小。同時，通過與對照品釋放模型的擬合及f2的比較，表明自制品與對照品體外釋放行為相似，相關(guān)性良好，并且動力學特征以Higuchi方程擬合較好。

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