高效體積排阻色譜-示差折光檢測器-多角激光光散射儀聯(lián)用測定右旋糖酐70原料藥的分子質(zhì)量

闞微娜，滕艷坤，楊宏偉（遼寧省食品藥品檢驗所，沈陽 110023）

右旋糖酐，又名葡聚糖，是一種由若干葡萄糖脫水形成的高分子聚合物，普遍應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，可提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外的水分以補充血容量，從而維護血壓擴充血容量的強度。臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用最普遍的右旋糖酐有3種，根據(jù)分子質(zhì)量大小分為右旋糖酐20、右旋糖酐40 和右旋糖酐70，均系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.-M-1226 號菌發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，再經(jīng)處理精制而得[1]。分子質(zhì)量及其分布是表征右旋糖酐的重要參數(shù)。右旋糖酐70是目前公認(rèn)的優(yōu)良血漿代用品之一，《中國藥典》要求右旋糖酐70 的重均分子質(zhì)量（Mw）應(yīng)為64 000～76 000[2]。

國際常見藥典中[2-4]均規(guī)定了右旋糖酐70的分子質(zhì)量的測定方法，即高效體積排阻色譜法（HPSEC）?！吨袊幍洹贩椒ㄖ行枰褂貌煌肿淤|(zhì)量的對照品，采用示差折光檢測器（RID），通過GPC分析軟件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品的分子質(zhì)量及其分布。筆者發(fā)現(xiàn)，使用不同來源的對照品測定同一右旋糖酐70的分子質(zhì)量，結(jié)果會出現(xiàn)一定的差別。為此，筆者試圖建立一種不需要對照品即可測定右旋糖酐分子質(zhì)量的HPSEC方法。經(jīng)不斷試驗，筆者最終建立了HPSEC法與RID、多角激光光散射儀（MALLS）聯(lián)機測定的方法，其中RID仍然為第一檢測器，MALLS 為第二檢測器。由于MALLS 為分子質(zhì)量響應(yīng)型檢測器，因此不需要已知分子質(zhì)量的對照品校正色譜柱，可直接測得樣品的絕對分子質(zhì)量[5]。筆者使用建立的方法對3批右旋糖酐70原料藥進行了測定，并將結(jié)果與采用《中國藥典》方法[2]分別用3種不同來源對照品計算得到的樣品分子質(zhì)量結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明建立的方法高效、準(zhǔn)確，可以直接測定樣品的分子質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器與軟件

LC-20A 型HPLC 儀，包括LC-20A 泵、SIL-20A 自動進樣器、CTO-20A 柱溫箱、RID-10A RID（日本島津公司）；18 角度激光光散射儀（波長：632.8 nm）、ASTRA4.90.08 軟件（美國Wyatte公司）；凝膠色譜軟件GPC 2010版（北京龍智達(dá)公司）。

1.2 藥品與試劑

右旋糖酐分子質(zhì)量對照品[中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院），批號分別為：140641-201002、140642-201002、140643-201002、140644-201002、140645-201002，峰位分子質(zhì)量Mp分別為：10 000、21 400、41 100、84 400、133 800]；葡聚糖分子質(zhì)量對照品P82（日本Shodex 公司，批號：51104，Mp分別為：22 800、47 300、112 000、212 000）；Fluka 葡聚糖分子質(zhì)量對照品（美國Sigma公司，批號：BCBG8021V，Mp分別為：23 800、48 600、80 900、147 600、273 000）；右旋糖酐70原料藥[山東某藥業(yè)公司，批號：A（120501）、B（110701）、C（100601）]；疊氮化鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPSEC-RID-MALLS方法

2.1.1 供試品溶液的配制。取供試品適量，加流動相適量稀釋至10 mg/ml。

2.1.2 色譜條件。色譜柱：TSK-GEL G4000SWXL（30 cm×7.5 mm，5 μm）；流動相：0.2 mol/L 氯化鈉水溶液（內(nèi)含0.02%疊氮化鈉），流速：0.8 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20μl；采集時間：20 min。RID常數(shù)：4.88×104；dn/dc值：0.135 ml/g；延遲體積：0.4 ml。分析軟件為ASTRA4.90.08。

供試品溶液（批號：A）色譜圖見圖1。

圖1 樣品A色譜圖1.RID譜圖；2.MALLS譜圖Fig 1 Chromatograms of sample A1.RID chromatograms；2.MALLS chromatograms

2.1.3 精密度試驗。稱取Mw為80 900 的Fluka 葡聚糖分子質(zhì)量對照品10 mg，加流動相1 ml，制成10 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置過夜。精密量取0.1 ml，注入色譜儀，連續(xù)進樣5次，測得Mw平均值為81 000，RSD＝0.66%（n＝5），平均值與標(biāo)準(zhǔn)值（80 900）之差為100，相對誤差為0.13%。

2.1.4 重復(fù)性試驗。稱取右旋糖酐70 原料藥（批號：A）50 mg，加流動相5 ml 溶解，共配制6 份，放置過夜；精密量取20μl，注入色譜儀。結(jié)果，6 份樣品Mw平均值為65 680，RSD＝0.9%（n＝6）；10%大分子部分重均分子質(zhì)量（M10）平均值為121 600，RSD＝1.1%（n＝6）；10%小分子部分重均分子質(zhì)量（M90）平均值為47 670，RSD＝0.95%（n＝6）。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 樣品分子質(zhì)量測定。取3批樣品，按“2.1.1”項下方法配制供試品溶液，注入色譜儀，測定3批供試品的Mw、M10、M90，結(jié)果見表1。

表1 HPSEC-RID-MALLS 法測定3 批樣品分子質(zhì)量結(jié)果（n＝2）Tab 1 Results of molecular weight of 3 batches of samples by HPSEC-RID-MALLS（n＝2）

2.2 《中國藥典》方法（HPSEC-RID方法）

2.2.1 色譜條件。色譜柱：TSK-GEL G4000SWXL（30 cm×7.5 mm，5 μm）；流動相：0.71%硫酸鈉水溶液（內(nèi)含0.02%疊氮化鈉），流速：0.5 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μl；采集時間：25 min。分析軟件為GPC。

2.2.2 溶液配制。對照品溶液：稱取Mp在15 000～200 000之間的3 種來源對照品約10 mg，分別用1 ml 流動相溶解，放置過夜，配制成3 種來源的對照品系列溶液。供試品溶液：同“2.1.1”項。

2.2.3 不同來源對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取“2.2.2”項下配制的不同來源的對照品系列溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件測定，并采用GPC軟件，以保留時間（T，min）為橫坐標(biāo)、分子質(zhì)量（M）的對數(shù)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，并繪制3 種來源葡聚糖對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果3 種來源對照品線性關(guān)系良好，見表2。

表2 3種來源葡聚糖對照品線性關(guān)系Tab 2 Linear range of 3 brands of dextran standard

2.2.4 樣品分子質(zhì)量測定。取3批供試品，按“2.1.1”項下方法配制供試品溶液，注入色譜儀，分別使用表2 中的3 個標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算3批樣品的Mw、M10、M90，結(jié)果見表3。

表3 HPSEC-RID法測定3批樣品分子質(zhì)量結(jié)果（n＝2）Tab 3 Results of molecular weight of 3 batches of samples by HPSEC-RID（n＝2）

3 討論

3.1 不同來源對照品對測定結(jié)果的影響

由表3 數(shù)據(jù)可知，采用Fluka 葡聚糖對照品與中檢院右旋糖酐對照品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分析3批樣品，這兩種方法的測定結(jié)果較為接近；而采用Shodex 公司葡聚糖對照品得到的樣品的結(jié)果偏低，甚至低于《中國藥典》規(guī)定的限度[2]，這為質(zhì)控結(jié)論的判定帶來一定的困難。中檢院的右旋糖酐對照品與Fluka葡聚糖對照品所使用的葡聚糖均為蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.-M-1226 號菌發(fā)酵后生成的高分子葡聚糖聚合物再經(jīng)精制而得，系與右旋糖酐同源的菌株發(fā)酵而來，而Shodex公司葡聚糖對照品使用的葡聚糖來源不清楚，由此初步分析可能是葡聚糖的來源與樣品來源有區(qū)別而導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此，采用不同來源、不同類別的對照品對樣品進行GPC 分析時，經(jīng)普適校正后更為合適。

3.2 HPSEC-RID-MALLS法與HPSEC-RID法結(jié)果比較

由表1和表3中的數(shù)據(jù)可知，采用HPSEC-RID-MALLS法的結(jié)果與采用HPSEC-RID法、中檢院與Fluka葡聚糖對照品的Mw結(jié)果相近，但是M10、M90的結(jié)果差別較大。因此，盡管兩種方法均采用凝膠色譜分離，但檢測和計算的手段完全不同。筆者認(rèn)為，從原理上講，HPSEC-RID-MALLS 法測定的結(jié)果應(yīng)更接近樣品分子質(zhì)量的真值。

3.3 HPSEC-RID-MALLS法優(yōu)勢

HPSEC-RID-MALLS 法不需要對任何標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行校正和標(biāo)定，具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，操作簡單，可實現(xiàn)連續(xù)性測定，同時還可用于分子質(zhì)量對照品的標(biāo)定，因此在質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中具有更廣闊的前景。

[1]韋肖鋒.關(guān)于右旋糖酐生產(chǎn)新工藝的探討[J].企業(yè)科技與發(fā)展，2012（3）：12.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：114.

[3]美國藥典委員會.美國藥典[S].34版.華盛頓：美國藥典委員會，2011：2 521.

[4]英國藥典委員會.英國藥典[S].2010年版.倫敦：英國藥典委員會，2010：655-656.

[5]李京，范慧紅.高效體積排阻色譜與多角激光光散射儀聯(lián)機測定低分子肝素分子量及分子量分布[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44（2）：140.