響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶水解技術(shù)生產(chǎn)嬰幼兒配方米粉工藝

劉梅森，林漢卿，張向陽(yáng)，高麗霄，何小勇，張織芬，臧成國(guó)

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶水解技術(shù)生產(chǎn)嬰幼兒配方米粉工藝

劉梅森，林漢卿，張向陽(yáng)，高麗霄，何小勇，張織芬，臧成國(guó)

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

為優(yōu)化雙酶水解技術(shù)生產(chǎn)嬰幼兒米粉工藝，以α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量、調(diào)漿水溫度為主要影響因素，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的其他水解條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，探討α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量、調(diào)漿水溫度的最佳組合。結(jié)果表明：α-淀粉酶添加量0.04?（相當(dāng)于0.15 U/g）、β-淀粉酶添加量0.26%（相當(dāng)于1 820 U/g）、調(diào)漿水溫度70.2 ℃時(shí)生產(chǎn)米粉的淀粉消化指數(shù)高達(dá)39.26%，與市售品牌米粉相比，淀粉消化指數(shù)提高10%以上。

嬰幼兒配方米粉；α-淀粉酶；β-淀粉酶；調(diào)漿水溫度；消化指數(shù)；響應(yīng)面法

嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉作為我國(guó)傳統(tǒng)的母乳替代品或嬰幼兒的補(bǔ)充、輔助食品而備受關(guān)注。由于攝取輔食嬰幼兒的胃、腸內(nèi)淀粉水解酶較少，對(duì)淀粉類食品的消化能力差，傳統(tǒng)的米粉制品常使嬰幼兒產(chǎn)生脹氣、腹瀉等消化問題[1-3]。為了改善米粉的消化性能，有的米粉廠家開始研究并采用α-淀粉酶水解工藝[4-6]，α-淀粉酶作用淀粉分子中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，水解從分子內(nèi)部進(jìn)行，水解中間位置的α-1,4-葡萄糖苷鍵，先后次序沒有一定規(guī)律，短時(shí)間內(nèi)將淀粉大分子水解成較小分子質(zhì)量的糊精[7]；有的米粉廠家采用先α-淀粉酶水解，再添加葡萄糖淀粉酶進(jìn)行糖化的工藝，合理控制酶解程度。以上酶解工藝都是將淀粉大分子水解成短鏈小分子，一定程度上提高了米粉的消化性能，使其更易吸收。在生產(chǎn)中，淀粉回生也會(huì)降低米粉的消化性。眾所周知，淀粉加熱糊化后隨著溫度的降低，淀粉分子鏈趨于平行排列，相互靠攏，經(jīng)氫鍵重新締合成結(jié)晶性結(jié)構(gòu)，不能被淀粉酶水解，這就是淀粉的回生過程，回生一定程度上也會(huì)影響淀粉的消化性。有關(guān)抑制回生的研究表明大米淀粉外側(cè)短鏈聚合度一般為15～18，鏈長(zhǎng)10 個(gè)單元以上易形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，加速回生[8-11]，用β-淀粉酶切斷大米支鏈淀粉外側(cè)支鏈可以有效抑制回生[12-15]。所以，本研究采用α-淀粉酶和β-淀粉酶生物酶解技術(shù)，控制酶解葡萄糖值在10%左右[16]生產(chǎn)嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)米粉，首先通過α-淀粉酶將淀粉長(zhǎng)鏈大分子降解成短鏈小分子，提高了米粉的消化性能，減輕嬰幼兒腸胃消化負(fù)荷；通過β-淀粉酶修飾大米支鏈淀粉外側(cè)支鏈抑制淀粉回生，消除回生帶來的消化性的降低。雙酶工藝生產(chǎn)嬰幼兒配方米粉中有關(guān)酶解程度控制研究另見后續(xù)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 北京三安科技集團(tuán)；蔗糖 廣西農(nóng)墾糖業(yè)集團(tuán)昌菱制糖有限公司；低聚果糖、低聚半乳糖 江門量子高科生物股份有限公司；奶粉 恒天然集團(tuán)；花生油益海嘉里糧油有限公司；磷脂 杜邦Solae公司；濃縮乳清蛋白 美國(guó)Hilmar公司；大豆膳食纖維 山東谷神生物科技集團(tuán)；二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，AA）廣東潤(rùn)科生物工程有限公司；中溫α-淀粉酶（800 FΑU/g）諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；β-淀粉酶（70萬 U/mL） 山東隆大生物工程有限公司；胰酶美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

MG0505滾筒干燥機(jī) 江蘇東臺(tái)市億民食品機(jī)械廠；DF-15粉碎機(jī) 浙江大德制藥有限公司；80L調(diào)漿罐浙江蒼南縣立甌石化設(shè)備有限公司；752-P紫外分光光度計(jì) 上海現(xiàn)科儀器有限公司；HHS-6S水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠；BL-2000S電子天平 美國(guó)西特公司；TG16-WS離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 嬰幼兒谷基配方米粉生產(chǎn)工藝

1.3.1.1 工藝流程

大米→粉碎→調(diào)漿→酶處理→添加輔料→細(xì)化→滾筒干燥→成型→檢驗(yàn)→包裝

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

粉碎：使用粉碎機(jī)將大米粉碎，過篩得到小于80 目（0.180 mm）的大米粉。

調(diào)漿：將大米粉使用一定溫度調(diào)漿水調(diào)制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的淀粉乳。

酶處理：量取一定量的α-淀粉酶（pH 5.8，55～65 ℃，3 700 U/mL）和β-淀粉酶（pH 5.8，55～65 ℃，70萬 U/mL），用少量水稀釋后，添加到淀粉乳中保溫酶解40 min。

添加輔料：將奶粉、大豆分離蛋白、磷脂（先加水乳化）、蔗糖（先在化糖鍋中溶化）和大豆膳食纖維等依次加入調(diào)漿罐中，混合均勻。

細(xì)化：混合均勻后的混合料通過膠體磨細(xì)化。

滾筒干燥：滾筒干燥機(jī)蒸汽壓強(qiáng)調(diào)至0.5 MPa，轉(zhuǎn)速3 r/min。

1.3.2 酶活性測(cè)定方法

酶活性定義：在實(shí)驗(yàn)溫度和pH值條件下，1 g（或1 mL）酶在1 h內(nèi)完全水解1 g淀粉為一個(gè)酶活力單位（單位為U/g或U/mL）。

酶活性測(cè)定[17]：分別于具塞試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%可溶性淀粉10.0 mL、pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液5.0 mL，于40～65 ℃水浴中預(yù)熱5 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的酶液0.5 mL，混勻并計(jì)時(shí)。按一定時(shí)間間隔取出酶解液，在白瓷板中以I2-KI液試之，待顏色變?yōu)槌赛S色時(shí)，記錄反應(yīng)時(shí)間。

式中：t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.3 米淀粉體外消化性能

對(duì)米淀粉經(jīng)酶解、滾筒干燥后得到的成品米粉進(jìn)行體外消化性能的測(cè)定。根據(jù)Englyst等[18]對(duì)淀粉按其消化特性進(jìn)行的劃分，用淀粉消化指數(shù)（starch digestion index，SDI）表征淀粉體外消化速率。采用豬胰酶水解米粉淀粉的方法，根據(jù)酶解速率計(jì)算產(chǎn)品的SDI值[19-22]。

取5 g樣品分別于250 mL燒杯中，加入蒸餾水50 mL、pH 7.2磷酸緩沖液10 mL，置于37℃水浴 中保溫5 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%豬胰酶0.4 mL。反應(yīng)過程中，不斷取出約1 g漿料于預(yù)先添加了10 mL水的試管中，立即放入沸水浴中4 min使酶失活（預(yù)實(shí)驗(yàn)4 min已完全失活），冷卻，于6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中定容。吸取2 mL已定容樣液，置于25 mL比色管中，再加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水顯色5 min，然后以流水迅速冷卻，用水定容至25 mL，搖勻。以試劑空白調(diào)零，在540 nm波長(zhǎng)處比色，參照預(yù)先制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖含量，同法平行操作2 份，得出平均還原糖含量。

大米淀粉的消化性能通過快速消化淀粉（rapidly digested starch，RDS）、慢速消化淀粉和抗性消化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征。SDI是淀粉體外消化速率的常用指標(biāo)。

式中：D為20 min內(nèi)淀粉產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/g；F為理論上淀粉水解成葡萄糖的質(zhì)量/g；TS為總淀粉（total starch，TS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；RDS為快速消化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以淀粉消化指數(shù)為響應(yīng)值，選定α-淀粉酶添加量、β-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中淀粉酶添加量以占淀粉干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平編碼值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

圖1 1 α-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)影響Fig.1 Effect of α-amylase concentration on starch digestion index

2.1.1 α-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)的影響由圖1可知，淀粉消化指數(shù)隨著α-淀粉酶添加量的增加不斷增大，當(dāng)添加量超過0.04?時(shí)，淀粉消化指數(shù)增勢(shì)趨緩，考慮到添加過多的酶對(duì)米粉的淀粉消化指數(shù)提高不大，反而增加生產(chǎn)成本，所以選擇α-淀粉酶添加量為0.04 ?左右較為合適。

2.1.2 β-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)的影響

圖2 2 β-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)影響Fig.2 Effect of β-amylase concentration on starch digestion index

由圖2可知，淀粉消化指數(shù)隨著β-淀粉酶添加量的增加不斷的增大，當(dāng)添加量超過0.25%時(shí)，淀粉消化指數(shù)增勢(shì)趨緩，考慮到添加過多的酶對(duì)米粉的淀粉消化指數(shù)提高不大，還會(huì)引起生產(chǎn)成本的提高，所以選擇β-淀粉酶添加量為0.25%左右較為合適。

2.1.3 調(diào)漿水溫度對(duì)淀粉消化指數(shù)的影響

圖3 調(diào)漿水溫度對(duì)淀粉消化指數(shù)影響Fig.3 Effect of water temperature on starch digestion index

由圖3可知，在酶添加量不變的情況下，淀粉消化指數(shù)隨著調(diào)漿水溫度的升高先增加后減少，當(dāng)調(diào)漿水溫度為70 ℃時(shí)，淀粉消化指數(shù)最大，所以選擇調(diào)漿水溫度為70 ℃左右較為合適。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化米粉酶解生產(chǎn)工藝

2.2.1 模型建立及顯著性分析

根據(jù)表1方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，在17 個(gè)試驗(yàn)中，1～12是析因試驗(yàn)，13～17是中心試驗(yàn)，用來估算試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

由表3可以看出，Α、Α2、C2為顯著性影響因素。在各影響因素中，α-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)影響最大，其次是調(diào)漿水溫度和β-淀粉酶添加量。經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示。

Y=39.37+1.39Α+0.18B+0.33C+0.12ΑB-0.21ΑC+ 0.070BC-1.94Α2-0.40B2-4.00C2

由表3可見，整體模型的顯著水平P＜0.000 1，表明試驗(yàn)所選的二次多項(xiàng)模型具有高度顯著性，能夠很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定米粉最佳酶解工藝參數(shù)。同時(shí)，失擬項(xiàng)P=0.693 7＞0.05，表明差異不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起；該模型R2=99.51%，R2Adj=98.88%，說明該模型與試驗(yàn)?zāi)M性良好。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析

根據(jù)模型方程繪制淀粉消化指數(shù)響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖4～6所示。從圖中可以直觀地看出各因素對(duì)淀粉消化指數(shù)的影響。

圖4 4 α-淀粉酶添加量和β-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot for the effect of cross-interaction between α-amylase concentration and β-amylase concentration on starch digestion index

由圖4、5可以看出，當(dāng)β-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度不變時(shí)，淀粉消化指數(shù)隨α-淀粉酶添加量的增加而增加；當(dāng)α-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度不變時(shí)，淀粉消化指數(shù)隨β-淀粉酶添加量的增加而增加。α-淀粉酶添加量對(duì)淀粉消化指數(shù)影響較β-淀粉酶添加量顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。由圖5、6可以看出，當(dāng)α-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度不變時(shí)，淀粉消化指數(shù)隨β-淀粉酶添加量的增加而增大；在β-淀粉酶添加量不變時(shí)，淀粉消化指數(shù)先隨調(diào)漿水溫度的升高而增加，達(dá)到一定溫度后反而逐漸減少。

圖5 5 α-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度對(duì)淀粉消化指數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot for the effect of cross-interaction between α-amylase concentration and water temperature on starch digestion index

圖6 6 β-淀粉酶添加量和調(diào)漿水溫度對(duì)淀粉消化指數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between β-amylase concentration and water temperature on starch digestion index

通過對(duì)模型方程求導(dǎo)計(jì)算，得到最高的淀粉消化指數(shù)酶解工藝參數(shù)為α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、調(diào)漿水溫度70.17 ℃，由模型方程預(yù)測(cè)得到此時(shí)的淀粉消化指數(shù)是39.65%。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，以α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、70.2 ℃調(diào)漿水生產(chǎn)米片，通過3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得米片的淀粉消化指數(shù)依次是39.01%、39.41%和39.36%，平均值是39.26%，與模型方程預(yù)測(cè)值基本一致。

2.3 不同品牌米粉淀粉消化性能比較

按照2.2.2節(jié)中米粉優(yōu)化工藝再添加奶粉、蔗糖、濃縮乳清蛋白、DHA等輔料生產(chǎn)米粉，將酶解工藝生產(chǎn)米粉與本公司非酶解工藝生產(chǎn)米粉、市售3種暢銷米粉進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn)測(cè)定其淀粉消化性能[16]，測(cè)定結(jié)果如表4所示。研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行輸入，并用SPSS軟件包進(jìn)行單因素方差分析。

表4 不同品牌米粉淀粉消化性能比較Table 4 Comparison of starch digestion among different brands of infant rice powder

從表4可以看出，本研究使用的雙酶工藝生產(chǎn)的米粉淀粉消化指數(shù)最高，達(dá)到39.41%，比市售非酶解工藝生產(chǎn)米粉、酶解工藝生產(chǎn)米粉淀粉消化指數(shù)都有不同程度的提高。與本公司非酶解工藝米粉相比，淀粉消化指數(shù)提高了85%，與市售品牌3米粉相比，淀粉消化指數(shù)提高108%。與其他品牌廠家酶解工藝生產(chǎn)的米粉，雙酶工藝生產(chǎn)的米粉在淀粉消化指數(shù)上仍有其優(yōu)勢(shì)，淀粉消化指數(shù)提高都超過10%。目前市售酶解工藝米粉多是運(yùn)用α-淀粉酶或α-淀粉酶結(jié)合葡萄糖淀粉酶生產(chǎn)，而本研究生產(chǎn)的米粉不僅從α-淀粉酶將淀粉長(zhǎng)鏈分子降解為短鏈小分子著手，還運(yùn)用β-淀粉酶剪切淀粉分子外側(cè)支鏈以抑制回生，從而有效抑制回生帶來的消化性能的降低。姚遠(yuǎn)等[23]通過米飯粒硬度和脈沖核磁共振測(cè)試表明，采用β-淀粉酶對(duì)米淀粉進(jìn)行適度降解可通過縮短支鏈淀粉分子的外側(cè)支鏈長(zhǎng)度而顯著延緩淀粉的回生速率，改善消化性能。

3 結(jié) 論

利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，探討提高淀粉消化指數(shù)的最佳酶解工藝參數(shù)，所建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蚍从稠憫?yīng)值的變化，對(duì)試驗(yàn)的擬合較好。優(yōu)化結(jié)果顯示，在α-淀粉酶添加量0.04?、β-淀粉酶添加量0.26%、調(diào)漿水溫度70.2 ℃條件下生產(chǎn)的米粉淀粉消化指數(shù)高達(dá)39.26%。以此條件為基礎(chǔ)生產(chǎn)的米粉與本公司非酶解工藝生產(chǎn)米粉、市售3 種品牌米粉比較，其淀粉消化指數(shù)提高10%以上。

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Optimization of Double Enzymatic Hydrolysis of Rice for Production of Infant Formula Rice Powder Using Response Surface Methodology

LIU Mei-sen, LIN Han-qing, ZHANG Xiang-yang, GAO Li-xiao, HE Xiao-yong, ZHANG Zhi-fen, ZANG Cheng-guo
(Shenzhen Weicky Biotechnology Co. Ltd., Shenzhen 518109, China)

The enzymatic hydrolysis of rice slurry with α-amylase and β-amylase for use in infant formula rice powder was optimized using a Box-Behnken design with response surface methodology. The optimal hydrolysis conditions were established as follows: 0.04? (equivalent to 0.15 U/g) α-amylase, 0.26% (equivalent to 1 820 U/g) β-amylase, and hydrolysis at 70.2 ℃, yielding a starch digestion index as high as 39.26%, which represented an over 10% increase over that reported for commercial infant rice powder.

infant formula rice powder; α-amylase; β-amylase; mashing temperature; starch digestion index; response surface methodology

TS216

A

1002-6630（2014）22-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201422012

2014-03-12

廣東省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)資金項(xiàng)目（2012B020402002）

劉梅森（1968—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：meisen18@sina.com