兩種自體靜脈移植再狹窄大鼠模型的對比研究＊

劉盛華，王武軍

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院胸心血管外科，廣州510405）

自體靜脈移植動物模型是研究冠狀動脈旁路移植（coronary artery bypass graft，CABG）術(shù)后再狹窄的主要方法，既可以研究靜脈橋的病理變化、發(fā)病機(jī)制，又可以用于檢驗(yàn)干預(yù)措施是否有效[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠為建模動物，以Cuff套管法為吻合方法，利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動脈和腹主動脈。建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型，將兩種模型的進(jìn)行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量300～350g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。蘇木素染液、伊紅染液由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。二甲苯、中性樹膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠分為A組和B組，每組15只。均以右側(cè)頸外靜脈作為自體移植靜脈，以Cuff套管法為吻合方法，A組將頸外靜脈移植至右側(cè)頸總動脈，B組移植至腹主動脈，分別建成兩種自體靜脈再狹窄的動物模型。

1.2.2 模型建立 （1）A組模型建立：10%水合氯醛按300 mg／kg行腹腔注射麻醉。1%肝素按250U／kg腹腔注射予以全身肝素化。固定大鼠，取右側(cè)胸鎖乳突肌前切口，長約3.0 cm，逐層切開。充分顯露頸外靜脈，長約1.5cm。采用“no touch”技術(shù)游離右側(cè)頸總動脈約2.0cm，取右側(cè)頸外靜脈作靜脈橋，長度約1.5cm，兩斷端用8／0無損傷縫線結(jié)扎，用肝素、罌粟堿生理鹽水沖洗管腔。右側(cè)頸總動脈兩端以無損傷“哈巴狗”血管夾阻斷血流，中間縱行切開約0.7cm，并用肝素、罌粟堿生理鹽水沖洗管腔。用長約3.0mm動脈穿刺外鞘管（20 G，1.1mm）自制套管。將頸外靜脈兩端分別穿過套管，用眼科鑷夾住殘端兩部分翻轉(zhuǎn)于套管體部上，6-0號絲線結(jié)扎套管固定。靜脈橋制作完后放置于肝素、罌粟堿生理鹽水中。用顯微剪在動脈兩端中間剪開，助手用兩把眼科鑷子牽開動脈管壁輔助，將待移植的右側(cè)頸外靜脈上下顛倒后分別插入右側(cè)頸總動脈兩端，6-0絲線結(jié)扎固定，然后將結(jié)扎線與套管固定進(jìn)一步防止滑脫。吻合完畢后依次開放遠(yuǎn)近端動脈夾，靜脈橋充盈，觀察搏動良好。徹底止血，術(shù)野消毒后縫合皮膚。（2）B組模型建立：以同樣的方法將右側(cè)頸外靜脈移植至腹主動脈。所有大鼠術(shù)后第1天開始每只肌注青霉素鈉4萬U／d，用至術(shù)后5 d，給予阿司匹林10mg·kg-1·d-1灌胃抗凝。

1.2.3 標(biāo)本采集 術(shù)后第1、2、4周分3次取材，每次每組隨機(jī)選取5只大鼠。大鼠麻醉后從原切口找到靜脈橋，觀察橋靜脈通暢后切取靜脈。切取靜脈橋標(biāo)本后處死大鼠。靜脈橋標(biāo)本用生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛沖洗固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度為4μm。每條靜脈標(biāo)本隨機(jī)選取不同位置的切片共5張，HE染色。

1.2.4 觀察指標(biāo) 每只大鼠選取5張切片，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量內(nèi)膜和中膜的厚度。每張切皮從3、6、9、12點(diǎn)鐘4個不同的位置測量，然后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

30只大鼠建模后全部成活。共30條橋靜脈均通暢，搏動良好。兩組大鼠手術(shù)時間、吻合時間比較 兩組大鼠手術(shù)過程順利，手術(shù)時間，見表1。B組手術(shù)時間、吻合時間均較A組長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組大鼠術(shù)后不同時間橋靜脈切片HE染色，見圖1、2。不同時間內(nèi)膜和中膜的厚度比較，見表2。兩組大鼠隨著術(shù)后時間的延長，內(nèi)膜和中膜的厚度也逐漸增厚。B組大鼠在第1、2、4周不同的時間點(diǎn)，內(nèi)膜和中膜的厚度分別與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 術(shù)后A組第1、2、4周靜脈橋切片HE染色（×400）

圖2 術(shù)后B組第1、2、4周靜脈橋切片HE染色（×400）

表1 A組與B組手術(shù)和吻合時間比較（±s，min）

表1 A組與B組手術(shù)和吻合時間比較（±s，min）

＊：P＜0.05，與A組比較。

15 40.5±3.3 17.9±3.1 B組 15 49.1±3.3＊ 23.4±2.8手術(shù)時間 吻合時間A組組別 n＊

表2 A組與B組大鼠術(shù)后不同時間橋靜脈內(nèi)膜和中膜的厚度比較（±s，μm）

表2 A組與B組大鼠術(shù)后不同時間橋靜脈內(nèi)膜和中膜的厚度比較（±s，μm）

組別 n 管壁厚度 第1周 第2周 第4周19.0±1.5 41.2±1.9 59.8±1.9中膜厚度 17.4±1.1 37.6±1.1 51.6±2.4 B組 15 內(nèi)膜厚度 18.6±1.3 40.8±2.2 59.4±1.9中膜厚度A組 15 內(nèi)膜厚度17.6±1.4 37.0±1.0 51.6±1.8

3 討 論

作為治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要方法之一，迄今CABG已歷經(jīng)40余年的臨床時間，尤其適用于多個危險(xiǎn)因素的患者[2]。乳內(nèi)動脈，尤其是做乳內(nèi)動脈由于其解剖位置的優(yōu)勢和長期的通暢率，一直以來都作為CABG術(shù)中前降支搭橋的最佳橋血管。但是在乳內(nèi)動脈條件較差時，大隱靜脈仍然是首選的橋血管。長期以來使其在CABG中得到了廣泛的應(yīng)用[3]。

隨訪資料顯示，乳內(nèi)動脈吻合前降支，1年通暢率達(dá)95.7%，10年通暢率在90.0%以上[4]，明顯優(yōu)于大隱靜脈。研究表明，大隱靜脈1年內(nèi)可能發(fā)生靜脈吻合口近端狹窄、血栓形成，1年、5年的通暢率分別為93.0%、74.0%。10年通暢率在50.0%～60.0%[5]，長期效果明顯不如乳內(nèi)動脈。靜脈橋的再狹窄大大降低了手術(shù)的遠(yuǎn)期效果，對于再狹窄的發(fā)生機(jī)制仍有許多不明之處，目前認(rèn)為再狹窄可能與大隱靜脈游離過程中的損傷，術(shù)后血流動力學(xué)的改變以及炎癥因子釋放等一系列變化，術(shù)后新生內(nèi)膜增生、血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、遷移所造成的血管重塑共同作用的結(jié)果[6]。術(shù)后較高的再狹窄發(fā)生率已經(jīng)成為影響自體靜脈在CABG術(shù)后中遠(yuǎn)期療效最主要的限制因素[7]。

3.1 建立靜脈橋再狹窄動物模型的現(xiàn)狀 靜脈移植動物模型是研究CABG術(shù)后再狹窄的主要方法，既可以研究靜脈橋的病理變化、發(fā)病機(jī)制，又可以用于檢驗(yàn)干預(yù)措施是否有效。目前，研究移植靜脈橋再狹窄的動物模型有豬、犬等大動物，也有大鼠、兔子等小動物。大動物操作相對簡單，但所需費(fèi)用較高。小動物價(jià)格便宜，易于飼養(yǎng)及管理。但由于其血管直徑小，吻合操作困難，需要具備血管吻合相關(guān)技能的人員操作。實(shí)驗(yàn)性自體靜脈移植模型多種多樣，血管橋主要為頸外靜脈和大隱靜脈，移植部位多在頸動脈、腹主動脈或股動脈。有研究表明，移植物早期再狹窄的主要原因是吻合技術(shù)和血栓形成[8]。在靜脈橋再狹窄模型的建立過程中血管吻合方法主要有連續(xù)縫合、間斷縫合和Cuff套管法[9]。目前，國內(nèi)外研究再狹窄的動物模型中關(guān)于大鼠血管移植模型的報(bào)道相對較少，主要是采用顯微外科縫合方法。因其需要精巧的纖維外科技術(shù)和很高的外科基本功，手術(shù)中操作空間小，常常因血管暴露不清造成誤縫或管壁撕裂，而導(dǎo)致吻合口出血和狹窄。因此，改進(jìn)靜脈移植模型，提高近期通暢率，減少手術(shù)操作本身對血管的損傷對延長大鼠術(shù)后存活時間十分必要。大鼠價(jià)格低廉，Cuff套管法建立頸外靜脈移植到頸總動脈模型，操作簡單，成功率高。該模型能真實(shí)地模擬靜脈橋旁路移植至動脈環(huán)境術(shù)后靜脈橋再狹窄的病理過程，是進(jìn)一步研究防治靜脈再狹窄的理想模型，有利于開展大規(guī)模的動物實(shí)驗(yàn)。此模型是研究移植靜脈內(nèi)膜增生和狹窄的發(fā)病機(jī)制、病理變化及探討其防治促使的理想動物模型。本研究利用大鼠頸外靜脈作為橋血管，分別將頸外靜脈移植至頸總動脈和腹主動脈，建立兩種自體靜脈再狹窄大鼠模型，將兩種模型的進(jìn)行對比研究。兩種模型均為目前動物實(shí)驗(yàn)中能反映CABG術(shù)后移植靜脈再狹窄病理過程所用的理想模型。設(shè)計(jì)制作一種簡單易行的移植血管再狹窄模型具有重要的實(shí)際意義。

3.2 選擇頸總動脈為移植部位的優(yōu)點(diǎn) 排除技術(shù)的干擾，盡管兩種動物模型的建立同樣能達(dá)到預(yù)期的效果。但髂動脈和腹主動脈的吻合由于需要進(jìn)入腹腔，對動物創(chuàng)傷較大，并發(fā)癥多，死亡率高。在供受血管選擇中，由于頸外靜脈解剖位置比較固定，便于尋找，且易于顯露游離，且移除單側(cè)靜脈對動物的全身影響較小。另外，頸總動脈距離心臟較近，動脈壓力較高，對移植靜脈內(nèi)膜損傷較大，易于更加真實(shí)地模擬CABG的病理生理變化。

3.3 Cuff套管技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 縫合法在收緊縫線時易造成管口的狹窄，又易于縫至對側(cè)，手術(shù)具有較大難度。目前，采用小動物建立模型的過程中血管的吻合方式逐漸發(fā)展為套管法，并且收到較好的效果[10-11]。本研究認(rèn)為，Cuff套管法較間斷縫合和連續(xù)縫合法操作簡單，并且無需顯微外科縫合，對手術(shù)者外科技術(shù)影響較小。一般不存在吻合口漏血情況，成功率較高。且因吻合口口徑大小一致，對內(nèi)膜損傷和血管剪切應(yīng)力小，通暢率高，手術(shù)時間也明顯縮短，Cuff套管法和縫合法吻合血管均能真實(shí)反映CABG術(shù)后靜脈橋再狹窄的情況，但前者更加簡單。是進(jìn)一步探尋CABG術(shù)后橋血管再狹窄病因和機(jī)制的理想模型。隨著Cuff套管技術(shù)的出現(xiàn)其在動物模型建立過程中的廣泛應(yīng)用。使血管移植模型的建立和推廣日漸可行。原裝進(jìn)口Cuff套管價(jià)格昂貴，國內(nèi)購買定制存在較大困難。本實(shí)驗(yàn)所采用Cuff套管利用臨床上較為常用的BD公司的動脈留置針套管（20G，1.1mm）制成。其材料易于獲得，又有一定的韌性，但又不過于堅(jiān)硬，其管徑與大鼠的頸外靜脈和頸總動脈基本吻合實(shí)驗(yàn)可用性強(qiáng)。自制的Cuff管遠(yuǎn)端可留一柄利于夾持，翻轉(zhuǎn)時不易造成損傷。實(shí)驗(yàn)動物中均未觀察到自制的套管有明顯的異物反應(yīng)，亦未見刺激局部血栓形成的現(xiàn)象。

3.4 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑦^程中的注意事項(xiàng) 顯露腹主動脈時，將胃和腸道用鹽水紗布包裹并向腹腔兩側(cè)推開即可達(dá)到良好顯露效果，動作要輕柔。切記操作過程粗暴，或?qū)⑽负湍c道拉出擺放在腹腔外，以免損傷腸管。關(guān)腹時腹腔內(nèi)注入少量生理鹽水使腸管漂起，輕揉兩側(cè)腹壁即可使腸管復(fù)位，防止術(shù)后發(fā)生腸扭轉(zhuǎn)及腸梗阻的發(fā)生。分離動、靜脈時采用“no touch”技術(shù)，盡量減少血管壁的損傷。分離頸總動脈時要避免損傷迷走神經(jīng)和氣管旁的小動脈。動脈分離完畢時，滴少于罌粟堿防止血管痙攣。下腔靜脈緊鄰腹主動脈，在分離下腔靜脈與腹主動脈時，要盡量避免損傷血管壁，尤其要避免損傷下腔靜脈，否則會出現(xiàn)致命性的出血獲取靜脈橋后要用肝素水反復(fù)沖洗干凈，預(yù)防血栓形成。Cuff套管中間可作一切跡，以防止血管橋滑脫套管翻轉(zhuǎn)時。開放靜脈橋時，應(yīng)先開放遠(yuǎn)端并排氣，再開放近端，以防止氣體栓塞，從而提高動物成活率。為了避免移植靜脈血管出現(xiàn)扭曲，可在一端動靜脈口吻合完畢后，短暫開放此端動脈夾使靜脈橋血管輕度充盈以使靜脈自然伸直。

綜上所述，Cuff套管法建立大鼠頸外靜脈移植到頸總動脈模型，操作簡單，成功率高，無近期免疫排斥反應(yīng)，有利于開展大規(guī)模的動物實(shí)驗(yàn)。兩種模型均是研究移植靜脈增生和狹窄的發(fā)病機(jī)制、病理變化及防治措施的理想的動物模型。

[1] Schachner T，Laufer G.Bonatti J.In vivo（animal）models of vein graft disease[J].Eur J Cardiothorac Surg，2006，30（3）：451-463.

[2] Marui A，Okabayashi H，Komiya T，et al.Benefits of Offpump coronary artery bypass grafting in high-risk patients[J].Circulation，2012，126（1）：S151-S157.

[3] Tsakok M，Taylor SM，Tsakok T.Storage of saphenous vein grafts prior to coronary artery bypass grafting：is autologous whole blood more effective than saline in preserving graft function[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg，2012，15（4）：720-725.

[4] Lawrie GM，Morris GC Jr，Earle N.Long-term results of coronary artery bypass surgery：Analysis of 1698Patients followed 15to 20years[J].Ann Surg，1991，213（5）：337-385.

[5] Gao CQ，Liu ZY，Li BJ，et al.Comparison of graft patency for off-pump and conventional coronary arterial bypass grafting using 64-slice multidetector spiral computed tomography angiography[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg，2009，8（3）：325-329.

[6] Peykar S，Angiolillo DJ，Bass TA，et al.Saphenous vein graft disease[J].Minerva Cardioangiologica，2004，52（5）：379-390.

[7] Qiao A，Zeng Y，Xu X.Comparisons of hemodynamics in 1-way and 2-way CABG[J].J Biomed Eng，2006，23（2）：295-299.

[8] 肖雅瓊，孫宗全，張凱倫，等.大鼠自體頸外靜脈移植模型的建立與改進(jìn)[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：106-108.

[9] Kloppenburg GT，de Graaf R，Grauls GE，et al.Chlamydia pneumonia aggravates vein graft intimal hyperplasia in a rat model[J].BMC Microbiol，2007，7：111.

[10] Zou Y，Dietrich H，Hu Y，et al.Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis[J].Am J Patho，1998，153（4）：1301-1310.

[11] Mizuta T，Nakahara K，Shirakura R，et al.Total no-microsuture technique for rat lung transplantation[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1991，102（1）：159-160.