大鼠肢體缺血再灌注急性肺損傷細(xì)胞自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)

李躍兵，康于慶，葉 靖，趙振龍，林春水，秦再生，古妙寧△

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院麻醉科，廣州510515；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，杭州310005）

肢體缺血再灌注（limb ischemia-reperfusion，LIR）在臨床外科中較常見，如動脈損傷或栓塞后再通、斷肢再植、肢體創(chuàng)傷及止血帶的長時(shí)間應(yīng)用等；特別是在地震災(zāi)難中，肢體缺血損傷的致死、致殘率非常高，值得關(guān)注。挽救缺血肢體的關(guān)鍵是盡快恢復(fù)血液循環(huán)，但大量研究證明，LIR不僅影響局部缺血組織的存活和功能，還可造成全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），并可能導(dǎo)致多臟器功能衰竭（MODS），其中肺是最易受損的器官之一，易造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]。近年來人們對LIR所致ALI的機(jī)制研究多集中在損傷與氧化應(yīng)激方面，凋亡、壞死被認(rèn)為是缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I／R）組織細(xì)胞的病理結(jié)局[2-5]。但隨著研究的深入，自噬被認(rèn)為能夠被各種損傷及氧化應(yīng)激等誘發(fā)[6-8]。本研究旨在觀察大鼠LIR-ALI肺組織細(xì)胞早期自噬及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性SPF級SD大鼠12只，體質(zhì)量220～250g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2011-0015]。所有動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作程序符合南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 Trizol（Invitrogen公司）、第1鏈cDNA的合成試劑盒（TaKaRa公司）、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）試劑盒（TaKaRa公司）、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司產(chǎn)品）、GDS7600（DF-23B）凝膠掃描系統(tǒng)（英國UVP公司）、Stratagene Mx3000PReal time PCR儀（美國Agilent公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 采用大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h制備LIR-ALI模型。實(shí)驗(yàn)前大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1d，術(shù)前禁食12h，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前2h禁水。隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組及I／R組，每組6只。稱質(zhì)量后大鼠3%戊巴比妥鈉（首劑40mg／kg，維持劑量20mg／kg）腹腔注射麻醉后固定于動物手術(shù)臺上。Sham組僅雙側(cè)股三角處切開皮膚，分離出股動脈，絲線標(biāo)記不結(jié)扎，縫合創(chuàng)口。I／R組分離出股動脈后，于近腹股溝韌帶處用無創(chuàng)微動脈夾夾閉股動脈使雙下肢缺血，縫合創(chuàng)口再以適度松緊的橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎雙下肢根部以防側(cè)支循環(huán)，以捫不到足背動脈搏動、雙足變暗變涼為缺血成功的標(biāo)志；3h后打開原切口，去除動脈夾恢復(fù)雙下肢血流再灌注4 h，動脈搏動恢復(fù)及雙足逐漸變紅變暖為建立LIR模型成功。

1.3.2 觀察指標(biāo) （1）再灌注4h末即刻剖開胸腔，直視下經(jīng)心尖部穿刺抽取3～4mL全血，4℃、3 000r／min離心10min后取上清液，置于-70℃凍存待測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH），并放血處死大鼠。（2）取雙肺組織，4℃的冰0.9%NaCl溶液浸泡，肺變白后取下左肺放置于4%的多聚甲醛固定24h以上，石蠟包埋后切片行免疫熒光染色測量，采用盲法由?？漆t(yī)師在倒置熒光顯微鏡下閱片，觀察肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體的表達(dá)，并利用Image J2x軟件進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度分析。（3）利用RT-PCR法檢測各組肺組織Beclin1和自噬相關(guān)基因（autophagy related genes，ATG）5mRNA表達(dá)：取右側(cè)肺組織100mg，采用Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，然后采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下 GAPDH 正向引物：5′-CCT CGT CTC ATA GAC AAG ATG GT-3′，反向引物：5′-GGG TAG AGT CAT ACT GGA ACA TG-3′；Beclin1正向引物：5′-GGG GCC TAA AGA ATG GAG GG-3′，反向引物：5′-CGT GTC CAG TTT CAG AGG CT-3′；ATG5正向引物：5′-ACT GAA CGA GAA GCA GAG CC-3′，反向引物：5′-TGT TCC AAG GCA GAG CTG AG-3′，引物是由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，用 Agilent Stratagene RT-PCR儀Mx3000P進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，測定Beclin1和ATG5mRNA的表達(dá)定量。（4）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測LC3蛋白表達(dá)：取下剩余右側(cè)肺組織100mg，-80℃保存，Western blot測量肺組織LC3蛋白含量，并計(jì)算LC3-Ⅱ／GAPDH的蛋白含量比值。目的蛋白采用SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜和凝膠，將凝膠用靠馬斯亮藍(lán)染色觀察轉(zhuǎn)移效率；將PVDF膜分別放入裝有3mL抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ抗體中，洗膜后再放入含有3mL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，1%BSA-TBS 1∶5 000稀釋；最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影及定影，將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶凈光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并做方差齊性檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血清LDH測定 血清LDH Sham組為（2.35±0.01）U／L，I／R組為（6.66±0.03）U／L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝119.242，P＝0.000）；I／R組血清LDH 的活性顯著升高，提示大鼠LIR-ALI模型制備成功。

2.2 肺組織免疫熒光病理變化及特異性標(biāo)記抗體表達(dá) 免疫熒光染色鏡下Sham組可見正常肺組織且結(jié)構(gòu)清晰，而I／R組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡壁增厚；免疫熒光強(qiáng)度值Sham組為5.54±0.09，I／R組為9.58±0.21，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝17.979，P＝0.000）；I／R組的肺組織免疫熒光特異性標(biāo)記抗體高表達(dá)，見圖1。

圖1 兩組大鼠的肺組織免疫熒光圖（×10）

2.3 肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達(dá) I／R組與Sham組Beclin1和 ATG5mRNA 2-△△CT比值分別為12.72±0.13、18.34±0.08，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達(dá)結(jié)果（±s）

表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達(dá)結(jié)果（±s）

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續(xù)表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達(dá)結(jié)果（±s）

續(xù)表1 兩組大鼠的肺組織Beclin1和ATG5mRNA相對定量表達(dá)結(jié)果（±s）

2-△△CT：I／R組目的基因表達(dá)相對于Sham組的變化倍數(shù)；＊＊：P＜0.01，與Sham組比較。

組別 ATG5CT GAPDH CT △CT（Avg.ATG5CT-Avg.GAPDH CT） △△CT（Avg.△CT-Avg.△CT mean） 2-△△CT Sham組 28.68±0.06 18.96±0.07 9.72±0.09 0.00±0.09 1.00±0.09 I／R組 24.61±0.05 19.08±0.06 5.53±0.08 -4.20±0.08 18.34±0.08＊＊

2.4 Western blot法檢測LC3蛋白含量及LC3-Ⅱ／GAPDH比值 LC3-Ⅰ蛋白含量凈光密度值Sham組1 699.646±20.761，I／R組6 707.375±42.641，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝105.590，P＜0.01）；LC3-Ⅱ蛋白含量凈光密度值Sham組5 783.733±53.297，I／R組12 961.459±204.518，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝33.962，P＜0.01）；GAPDH 蛋白含量凈 光 密 度 值 Sham 組 7 631.270±45.566，I／R 組7 531.818±8.651，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.144，P＞0.05）；LC3-Ⅱ／GAPDH比值，Sham組0.758±0.007，I／R組1.721±0.027，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝34.130，P＜0.01），見圖2、3。

圖2 兩組大鼠的肺組織LC3蛋白Western blot結(jié)果

圖3 兩組大鼠的肺組織LC3蛋白水平

3 討 論

自噬與凋亡的關(guān)系是生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，雖然自噬在除肺組織以外的臟器系統(tǒng)中研究取得了較大進(jìn)步，但有關(guān)LIR-ALI與自噬方面的相關(guān)研究甚少[9]。自噬為真核細(xì)胞所特有，是細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分利用溶酶體被降解過程的統(tǒng)稱。細(xì)胞對內(nèi)外環(huán)境壓力變化如發(fā)育、衰老、損傷、缺血缺氧等可誘發(fā)自噬，在某些情況下還可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬被認(rèn)為是區(qū)別于細(xì)胞凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡形式，前者屬Ⅰ型，后者為Ⅱ型[10]。

有研究認(rèn)為，常溫下肌肉骨骼肌是肢體最易缺血的組織，僅可耐受缺血4h[11]。肢體I／R可引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺血管細(xì)胞損傷，而自噬可能是該類損傷的一種可誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。自噬的發(fā)生需要眾多關(guān)鍵ATG的參與，其中ATG12和ATG5結(jié)合形成自噬體前體，他們的高表達(dá)促進(jìn)自噬的激活[12]。本研究中，大鼠雙下肢缺血3h再灌注4h引起了肺組織免疫熒光染色特異性標(biāo)記抗體的高表達(dá)，而用半定量RTPCR法測定Beclin1和ATG5mRNA相對表達(dá)量亦增高，促進(jìn)了自噬的激活。

目前測量自噬的作用途徑大致分為3類：顯微鏡檢查、靜態(tài)生化測量（如 Western blot）、動態(tài)生化測量。其中，免疫熒光染色法能更好地檢測各個(gè)時(shí)期的自噬小體，而自噬最多的檢測方法是利用 Western blot檢測LC3[13]。

LC3-Ⅰ／Ⅱ和Beclin1是兩個(gè)重要的自噬相關(guān)分子，被廣泛地用來研究自噬的發(fā)生、發(fā)展。LC3是自噬體的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)，細(xì)胞質(zhì)中的LC3前體通過蛋白水解轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅰ，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成磷脂酰乙醇胺結(jié)合的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被認(rèn)為是自噬性細(xì)胞死亡的特異性分子標(biāo)志物[13]。特別是LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正比，因此可以根據(jù)LC3的水平來推測自噬作用的大小。在肺血管細(xì)胞中，炎性標(biāo)志物高表達(dá)引發(fā)自噬，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化增加并聚集，自噬量進(jìn)一步增加，從而引起肺支氣管上皮細(xì)胞死亡及組織損傷[14]。本研究中大鼠 LIR-ALI模型 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ／GAPDH均增高，說明LIR-ALI導(dǎo)致肺組織自噬上調(diào)。

綜上所述，LIR-ALI可誘導(dǎo)自噬發(fā)生并促其相關(guān)蛋白高表達(dá)，本研究為進(jìn)一步明確LIR-ALI與自噬的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。筆者將利用該抑制劑和激活劑進(jìn)一步研究LIR-ALI的作用機(jī)制及臨床藥物／技術(shù)對其干預(yù)效果。

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