牡蠣多糖提取及其對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用

侯 麗，汪秋寬，何云海，任丹丹，宋悅凡，姜曉東，李麗迪

（大連海洋大學(xué)，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

牡蠣多糖提取及其對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用

侯 麗，汪秋寬*，何云海，任丹丹，宋悅凡，姜曉東，李麗迪

（大連海洋大學(xué)，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

牡蠣是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，且含有豐富的糖原和多糖。利用水提醇沉法提取牡蠣多糖，通過實(shí)驗(yàn)研究了牡蠣多糖對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)將昆明小鼠隨機(jī)平均分為6組，分別對小鼠灌胃80、160、320mg/（kg·d）不同劑量的牡蠣多糖，30d后灌胃50度乙醇造成小鼠急性肝損傷模型，以200mg/（kg·d）的聯(lián)苯雙酯做陽性對照，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性、乙醛脫氫酶（ALDH）水平及肝組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、乙醇脫氫酶（ADH）活性，并觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化，研究牡蠣多糖對乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果表明：牡蠣多糖各劑量均能抑制肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的升高，且低、中、高劑量組達(dá)到顯著水平，并能顯著提高肝組織中SOD、ADH活性，降低MDA含量，減輕酒精對肝細(xì)胞的病理傷害。研究表明，牡蠣多糖具有保護(hù)小鼠急性酒精肝損傷的作用。

牡蠣多糖，肝損傷，肝保護(hù)

我國酒精性肝損傷的發(fā)病率逐年增加，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。牡蠣，俗稱海蠣子、蠔，屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，異柱目，牡蠣科動(dòng)物，棲息在淺海泥沙當(dāng)中，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，也是世界上第一大養(yǎng)殖貝類[2]。其味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值豐富，是一種具有藥用價(jià)值的海洋經(jīng)濟(jì)貝類動(dòng)物，歷來受世人推崇[3]。根據(jù)分析，其肉中除含有豐富的蛋白質(zhì)外還存在大量的糖原和多糖，占其干重的20%～40%[4]。國內(nèi)外報(bào)道了從牡蠣中提取的牡蠣多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物活性[5-8]。王俊等[6]利用熱堿法提取的牡蠣多糖粗品能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫功能，并且具有一定的抗腫瘤與抗氧化作用。陳艷輝等[7]利用廣西牡蠣制備出的牡蠣多糖在一定濃度下對鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用。李志等[8]研究表明牡蠣多糖在體外可抑制自由基的損傷，另外他們還通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明牡蠣多糖能影響免疫細(xì)胞的生成，增強(qiáng)機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫，從而達(dá)到正向免疫調(diào)節(jié)。牡蠣多糖的多種生理功能已引起廣大研究者的廣泛興趣，有關(guān)研究工作已取得較大進(jìn)展，但牡蠣多糖對小鼠急性酒精肝損傷保護(hù)作用的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以牡蠣為材料制備牡蠣多糖，并研究了牡蠣多糖對酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，進(jìn)一步研究牡蠣的藥用價(jià)值，為深入開發(fā)海洋藥用資源打下基礎(chǔ)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 大連黑石礁市場；昆明種小鼠 60只，雄性（22±2）g，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物檢驗(yàn)合格證號：SCXK（遼）2008-0002；聯(lián)苯雙酯（DDB） 北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品（批號11090205）；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒（批號20130413）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測定試劑盒（批號20130413）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號20130413）、超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）測 定 試 劑 盒（批號20130415）、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號20130415）、乙 醇 脫 氫 酶（ADH）測 試 盒（ 批 號20130417）、乙醛脫氫酶（ALDH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號20130416） 均購于南京建成生物工程公司；牛血清蛋白 上海浦江生物化學(xué)研究所；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 東北制藥總廠一分廠產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用其他試劑 均為分析純。

原子吸收分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UV-754分光光度計(jì) 上?？等A生化儀器制造廠；LD5-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 牡蠣粗多糖的制備 新鮮牡蠣肉勻漿后，準(zhǔn)確稱取1kg后，加入1L 95%乙醇，在常溫下攪拌1.5h，靜置、4900r/min離心15min后，取沉淀部分，加入1L去離子水于90℃水浴中浸提2h后，冷卻、靜置，4900r/min離心15min，收集上清液，并將沉淀部分重復(fù)提取一次，合并濾液。調(diào)節(jié)pH4.6，4900r/min離心15min收集上清液，加入酒精至酒精濃度為70%，4900r/min離心15min，取沉淀后，真空冷凍干燥后得牡蠣多糖粗提物[8-12]。

1.2.1.2 牡蠣粗多糖成分及重金屬含量的測定 總糖 含 量 的 測 定 依 照 苯 酚 硫 酸 法[13]，蛋 白 質(zhì) 含 量 的 測定方法為福林酚試劑法[14]，水分含量測定參照GB/T 5009.3-2003，用直接干燥法測定水分含量[15]，重金屬含量的測定為原子吸收法[16-19]。

1.2.2 牡蠣多糖對肝損傷的保護(hù)作用

1.2.2.1 模型制備及給藥 將小鼠按體重隨機(jī)分組，分別為空白對照組，空白模型組，聯(lián)苯雙酯陽性對照組 ，牡 蠣 多 糖 低（80mg/kg·d）、中（160mg/kg·d）、高（320mg/kg·d）劑量組，共6組，每組各10只。給藥組每天灌胃給藥1次，連續(xù)30d，空白對照組與空白模型組給予同體積生理鹽水，牡蠣多糖劑量組給予蒸餾水溶解的牡蠣多糖，于末次給藥后1h，對照組灌胃生理鹽水，其余每組均按12mL/kg經(jīng)口灌胃50度乙醇。禁食24h后，摘除眼球取血，離心后取上層血清?？焖偬幩佬∈笕「闻K，并在肝左葉組織相同部位取約0.3g，放冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，用組織勻漿器制成10%肝組織勻漿，備測。

1.2.2.2 生化指標(biāo)檢測與病理學(xué)檢查 血清ALT、AST、ALDH的活性，肝組織MDA的含量、SOD、ADH的活性以及肝組織中的蛋白含量均按試劑盒要求進(jìn)行測定。處死小鼠后，取肝右葉組織，用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，蘇木精一伊紅（HE）染色，在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣多糖總糖、水分、蛋白質(zhì)、重金屬含量

測定結(jié)果表明，牡蠣多糖粗品提取率為15.389%（干基），牡蠣多糖純度為81.23%，水分含量8.15%，蛋白質(zhì)10.02%。重金屬Pb 0.46mg/kg，Cr 0.25mg/kg，Cd 0.08mg/kg，Cu 9.1mg/kg，無機(jī)砷含量未檢出，均符合國標(biāo)GB/T 2733-2005和 GB/T 2762-2005要求[20-21]。

表1 牡蠣多糖對小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影響（±S，n＝10）Table 1 Result of ALT，AST and ALDH activities of mice serum inhibitied by oyster polysaccharide（±S，n＝10）

表1 牡蠣多糖對小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影響（±S，n＝10）Table 1 Result of ALT，AST and ALDH activities of mice serum inhibitied by oyster polysaccharide（±S，n＝10）

注：與正常對照組相比，a：p<0.05，b：p<0.01；與正常模型組相比，c：p<0.05，d：p<0.01；與藥物對照組相比，i：p<0.05，j：p<0.01；表2同。

組別 劑量（mg/kg·d） ALT（U/L） AST（U/L） ALDH（μmol/L）正常對照組 － 8.18±4.05d 11.52±4.17d 1.84±0.28dhj正常模型組 － 31.12±1.47bhj 37.74±3.94bhj 7.57±1.83bhj藥物對照組 200 9.32±3.88d 14.50±2.33d 3.13±0.79bd牡蠣多糖低劑量組 80 8.82±4.97d 13.76±7.23d 3.16±1.12bde牡蠣多糖中劑量組 160 7.97±3.48d 12.34±2.49dg 2.71±0.33bd牡蠣多糖高劑量組 320 7.79±4.54d 13.91±3.46de 2.44±0.49bd

2.2 牡蠣多糖對小鼠血清ALT、AST、ALDH活性的影響

由表1可知，與正常對照組相比，模型組的小鼠血清ALT、AST及ALDH活性顯著上升，表明已成功構(gòu)建肝損傷模型。牡蠣多糖各劑量組的小鼠血清ALT和AST活性都顯著低于正常模型組（p＜0.05），說明各劑量都具有顯著降低小鼠血清ALT和AST活性的作用，且低、中、高各劑量組均優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組。與正常模型組相比，牡蠣多糖各劑量組的小鼠肝臟ALDH活性都顯著下降，說明多糖各劑量都具有顯著降低小鼠肝臟ALDH活性的作用。

表2 牡蠣多糖對小鼠肝臟MDA含量、SOD、ADH活性及肝臟指數(shù)的影響（±S，n＝10）Table 2 Effect of oyster polysaccharide on liver index,content of MDA，SOD and ADH activities of mice liver（±S，n＝10）

表2 牡蠣多糖對小鼠肝臟MDA含量、SOD、ADH活性及肝臟指數(shù)的影響（±S，n＝10）Table 2 Effect of oyster polysaccharide on liver index,content of MDA，SOD and ADH activities of mice liver（±S，n＝10）

組別 劑量（mg/kg·d） MDA（nmol/mgprot） SOD（U/mgprot） ADH（U/mgprot） 肝臟指數(shù)（mg/g）正常對照組 － 1.95±0.46di 161.80±23.93dhi 27.19±7.93d 36.81±7.04dhi正常模型組 － 3.51±0.45bhj 119.87±4.56b 18.38±5.80bh 45.62±4.87p藥物對照組 200 2.66±0.48dg 129.33±10.31c 24.11±15.04c 43.65±2.87b牡蠣多糖低劑量組 80 2.34±0.48dgi 110.62±22.37ad 39.23±11.26bdi 40.98±6.28a牡蠣多糖中劑量組 160 2.49±0.33dg 122.51±10.37c 36.26±7.95bdi 42.27±3.62bg牡蠣多糖高劑量組 320 2.20±0.21di 123.76±26.92c 25.74±7.14c 42.43±1.90bh

2.3 牡蠣多糖對小鼠肝臟MDA含量、SOD和ADH活性及肝臟指數(shù)的影響

由表2可知，與正常對照組相比，模型組的小鼠肝臟組織中的MDA含量顯著上升，SOD、ADH活性顯著下降，表明已成功構(gòu)建肝損傷模型。牡蠣多糖各劑量組的小鼠肝臟組織中的MDA含量都顯著低于正常模型組，說明各劑量都具有顯著降低小鼠肝臟組織中的MDA水平的作用，牡蠣多糖低、中、高各劑量組均優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組，其中牡蠣多糖低、高劑量組顯著優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組（p＜0.05）。牡蠣多糖中、高劑量組的小鼠肝臟組織中的SOD含量均高于正常模型組，說明牡蠣多糖中、高劑量組有升高小鼠肝臟組織中的SOD水平的作用。牡蠣多糖各劑量組的小鼠肝臟組織中的ADH活性都顯著高于正常模型組，說明各劑量組都具有顯著升高小鼠肝臟組織中的ADH活性的作用，且牡蠣多糖各劑量組均優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組，且牡蠣多糖低、中劑量組與聯(lián)苯雙酯組存在顯著性差異（p＜0.05）。對于肝臟指數(shù)，各劑量組均低于模型組，且均低于聯(lián)苯雙酯組。

2.4 牡蠣多糖對酒精肝損傷組織學(xué)影響

由圖1可見，在400×光鏡下，正常組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索狀排列規(guī)則，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常[21]。而空白模型組肝細(xì)胞發(fā)生腫脹現(xiàn)象，肝細(xì)胞索紊亂，細(xì)胞界限不清，有氣球樣變細(xì)胞，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。經(jīng)過牡蠣多糖組預(yù)處理過的小鼠肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞形狀基本規(guī)則，有少量炎癥細(xì)胞浸潤[22]。光鏡檢查結(jié)果表明，牡蠣多糖能明顯減輕酒精對肝組織的急性損傷。

3 討論

酒精（主要成分乙醇）進(jìn)入機(jī)體后，約90%在肝臟內(nèi)氧化，而肝臟是人體含酶最豐富的臟器，當(dāng)肝臟有實(shí)質(zhì)性損害時(shí)血清某些酶活性可升高。例如轉(zhuǎn)氨酶是人體代謝過程中必不可少的酶，當(dāng)肝細(xì)胞受損傷時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶被釋放到血液中，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。因此，轉(zhuǎn)氨酶在血清中活力高低反映了肝臟的受損傷程度。另外氧化應(yīng)激是酒精性肝損傷最重要的發(fā)病 機(jī) 制 之 一[22]，其 中 氧 自 由 基 在 酒 精 性 肝 病 的 發(fā) 生中起著重要作用。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的終產(chǎn)物，可引起細(xì)胞代謝及功能障礙甚至死亡，可以衡量組織過氧化損傷的程度MDA是脂質(zhì)過氧化物的最終代謝產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體的脂質(zhì)過 氧 化 程 度 ，從 而 反 映 肝 臟 細(xì) 胞 損 傷 的 程 度[23]。 而SOD是是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用的酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要成分，可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD水平的高低是衡量機(jī)體對抗氧自由基能力大小的重要因素，是反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，ADH（乙醇脫氫酶）和ALDH（乙醛脫氫酶）是酒精在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，乙醇經(jīng)ADH催化氧化成乙醛，乙醛再經(jīng)過ALDH催化氧化成乙酸，后者以乙酰CoA的形式進(jìn)入三羧酸循 環(huán) ，最 后 氧 化 成CO2和H2O排 出 體 外[24]。 因 而 測 定ALT、AST、MDA、SOD、ADH、ALDH的變化可初步反映肝損傷的程度[24-25]。

圖1 牡蠣多糖對肝損傷小鼠肝組織的病理學(xué)影晌（HE染色，400×）Fig.1 Effect of Oyster Polysaccharide on histopathological changes that occurred in mice during alcohol intoxication（dyeing by hematoxylin and eosin，400×）

4 結(jié)論

很多牡蠣提取物對于肝損傷都有一定的修復(fù)和保護(hù)作用，如張翠萍等[23]研究結(jié)果表明，牡蠣肝寶能有效降低肝組織中丙二醛含量并提高組織中還原性谷胱甘肽的含量，這與牡蠣肝寶中的?；撬岷吞窃扔嘘P(guān)。而本實(shí)驗(yàn)中牡蠣多糖運(yùn)用水提醇沉法，70%乙醇沉淀只針對大分子物質(zhì)例如多糖等，其中的?；撬?、糖原等小分子物質(zhì)一般不會(huì)被70%乙醇沉淀。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牡蠣多糖具有降低肝損小鼠血清ALT、AST、ALDH活力，并能顯著提高肝組織中SOD、ADH活力、降低MDA含量的能力。在光學(xué)顯微鏡下觀察了肝組織的形態(tài)學(xué)改變，其結(jié)果與所測得的生化指標(biāo)一致，均表明牡蠣多糖具有一定的保護(hù)肝臟的作用。其作用機(jī)制可能是提高了肝細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整及功能，而達(dá)到一定程度上拮抗酒精對肝細(xì)胞的損害作用，該機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The extraction of oyster polysaccharide and its hepatoprotective effect against alcohol-induced hepatic injury in mice

HOU Li，WANG Qiu-kuan*，HE Yun-hai，REN Dan-dan，SONG Yue-fan，JIANG Xiao-dong，LI Li-di
（The Key and Open Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Oyster polysaccharide was prepared from ostrea gigas thunberg by water extraction and alcohol precipitation.The hepatoprotective effect of oyster polysaccharide against alcohol-induced hepatic injury in mice was studied.The Kunming mice were oral administration daily with oyster polysaccharides at three doses of 80，160，320mg/kg respectively for 30 days.Then liver injury model was established by administration of 50 degrees intragastric ethanol in mice on the 30th day.The positive control was administrated with 200mg/kg dimethyl diphenyl bicarboxylate.The activities of serum ALT，AST and ALDH，the content of MDA and the activity of SOD，ADH in hepatic tissue were measured.The hepatic histological changes were observed by optical microscope.The results showed that oyster polysaccharides had significantly hepatoprotective activity on alcohol induced liver damage in mice．The serum AST，ALT，ALDH and liver lipid peroxides in mice administrated with oyster polysaccharides decreased significantly compared with those of experiment control．The contents of MDA and ADH in hepatic tissue were also decreased while the activities of SOD increased significantly for the mice with oyster polysaccharides compared with those of experiment control.Histopathological changes induced by alcohol were also significantly reduced by oyster polysaccharides treatment．The results indicated that oysters polysaccharides had a protective role in acute alcoholic liver injury in mice.

oyster polysaccharide；hepatoprotective effect；hepatic injury

TS254.1

A

1002-0306（2014）22-0356-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.070

2014－03－17

侯麗（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

* 通訊作者：汪秋寬（1962-），女，碩士研究生，教授，研究方向：水生生物資源利用。

遼寧省優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目。