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    生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖的分離純化

    2014-03-07 05:54:08馮再平沐萬孟
    食品工業(yè)科技 2014年22期
    關(guān)鍵詞:糖液生物轉(zhuǎn)化等電點

    馮再平,沐萬孟,江 波,*,張 濤,薛 冬

    (1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050;3.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司,浙江紹興 312000)

    生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖的分離純化

    馮再平1,2,沐萬孟1,江 波1,*,張 濤1,薛 冬3

    (1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050;3.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司,浙江紹興 312000)

    利用重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib,將原料D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化為具有抑癌效果的稀有糖D-阿洛糖。經(jīng)液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)鑒定,反應(yīng)混合液中25%的D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化成了D-阿洛糖。等電聚焦法測定了重組蛋白的等電點為6.3,并成功運用到產(chǎn)物混合液的去蛋白沉淀中。經(jīng)過預(yù)處理的混合糖液,通過DTFCa2+型離子交換樹脂實現(xiàn)了分離純化。最佳分離條件為:柱溫60℃,進(jìn)樣量4mL,流速1mL/min。

    D-阿洛糖,生物轉(zhuǎn)化,等電點沉淀,純化

    稀有糖(Rare sugar)是一類重要的碳水化合物,在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮著非常重要的功能。根據(jù)國際糖協(xié)會(ISRS)定義,已知的己糖和戊糖中,除了葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、核糖和L-阿拉伯糖等7種單糖在自然界大量存在以外,其余20種己糖和9種戊糖都屬于在自然界含量極少的稀有糖[1]。稀有糖一般具有低熱量、低吸收的特點,如D-塔格糖、D-阿洛酮糖等。D-阿洛糖由于具有廣泛的生理功能[2],特別是具有優(yōu)異的抑癌作用[3]和輔助癌癥放[4]、化療[5]的作用,而成為稀有糖功能性及生物轉(zhuǎn)化研究中的熱點。

    D-阿洛糖是D-葡萄糖的C-3位差向異構(gòu)體,屬于稀有糖,可利用化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。相對于化學(xué)法,生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、污染小等優(yōu)點。D-阿洛糖的生物轉(zhuǎn)化可以通過兩步反應(yīng)實現(xiàn)[6]:首先由較便宜的D-果糖出發(fā),通過D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose-3-epimerase,DTE)家族轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖[7];D-阿洛酮糖再由L-鼠李糖異構(gòu)酶(L-Rhamnose isomerase,L-RhI)[8]或者核糖-5-磷酸異構(gòu)酶B(ribose-5-phosphate isomerase,RpiB)[9]等酶類催化酮醛糖異構(gòu)化反應(yīng)從而獲得D-阿洛糖。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)稀有糖時,產(chǎn)物和底物通常以一定平衡比例混合存在于混合液中,因此解決產(chǎn)物分離的問題是稀有糖生產(chǎn)中必須面對的難題。通過Ca2+型陽離子樹脂配位交換可實現(xiàn)單糖的分離[10],D-阿洛酮糖與D-果糖的分離方法已有文獻(xiàn)報道[11],而D-阿洛糖與D-阿洛酮糖的分離尚未見報道。要實現(xiàn)D-阿洛糖在食品、制藥等領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用,先要解決生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)得到的混合糖液的分離純化問題。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    D-阿洛糖、D-阿洛酮糖 Sigma公司,(≥95%);DTF-Ca2+色譜分離樹脂 江蘇蘇青集團(tuán);IPG預(yù)制膠條 、 水 化 上 樣 緩 沖 液 美 國 Bio-Rad 公 司 ;CaCl2、DTT、丙酮、鹽酸等試劑 均為分析純。

    Agilent 1260高效液相色譜 Agilent公司;Sugar-PakTM1糖柱、UPLC/ES-QTOF-MS液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC色譜儀 Waters公司;HL-2B型數(shù)顯恒流泵、DBS-100自動部分收集器 上 海 滬 西 分 析 儀 器 廠 ;PowerPac Basic電 泳 設(shè)備 美國Bio-Rad公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 D-阿洛糖的生物轉(zhuǎn)化[9]RpiB酶因具有廣泛的底物特異性,可催化與磷酸糖相類似的單糖底物發(fā)生酮醛異構(gòu)化,而被應(yīng)用于D-阿洛糖的酶法生產(chǎn)。本實驗室構(gòu)建了可以表達(dá)Thermotoga lettingae TMO RpiB酶的重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib,誘導(dǎo)表達(dá)后獲得凍干菌體備用。在pH8.0,55℃條件下,適量凍干菌體振蕩轉(zhuǎn)化100g/L的D-阿洛酮糖底物24h。

    1.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定 LC-MS/MS檢測含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的產(chǎn)物混合糖液。色譜條件為:ACQUITY UPLC色譜儀,TSK-gel Amide-80氨基柱,流動相65%乙腈,柱溫35℃,流速0.3mL/min,進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件為:電噴霧離子(ESI)源;毛細(xì)管電壓3.0kV;錐孔電壓30V;離子源溫度100℃。將D-阿洛糖、D-阿洛酮糖標(biāo)樣及反應(yīng)產(chǎn)物分別上樣,測定分析,對照標(biāo)樣和樣品峰的出峰時間及質(zhì)譜碎片,分析樣品成分。

    1.2.3 重組酶蛋白等電點測定[12]采用離心配合等電點沉淀的方法除去混合糖液中大量存在的RpiB蛋白,需要先測定重組蛋白的等電點。純化得到電泳純度95%以上的重組蛋白,重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中,-20℃沉淀過夜。4℃,12000r/min離心30min,沉淀重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中,-20℃放置1h。4℃,12000r/min離心30min,在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā),得到干燥的沉淀。500μL水化上樣緩沖液充分溶解適當(dāng)量的蛋白粉末。在裝有預(yù)制膠條的水化盤中加入蛋白水化液,4℃水化過夜后進(jìn)行等點聚焦電泳、考馬斯亮藍(lán)染色。

    1.2.4 D-阿洛糖樣品預(yù)處理 經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物混合液,8000r/min離心30min除去菌體。調(diào)節(jié)溶液pH至等電點后煮沸,保持5min使產(chǎn)物混合液中的酶蛋白變性沉淀,12000r/min離心30min除去溶液中蛋白質(zhì)。采用陰陽離子色譜法脫鹽脫色[11],得到含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合糖液。

    1.2.5 DTF-Ca2+離子交換層析[13]DTF-Ca2+色譜分離樹脂的處理再生:180mL樹脂裝填到長1m,內(nèi)徑1.6cm的帶有恒溫夾套的層析柱,5%的鹽酸溶液沖洗至進(jìn)出口酸度相同后,浸泡4h,純水沖洗至中性;10%CaCl2溶液沖洗至流出液pH7.30后,浸泡4h,純水沖洗樹脂至中性。上樣一定量的混合糖液,以去離子水作為流動相,分別控制夾套溫度為55、60、65℃,進(jìn)樣量為4、8、12mL,流速為0.5、1、2mL/min進(jìn)行洗脫,部分收集器收集洗脫樣品。

    1.2.6 收集部分的HPLC檢測 HPLC測定各收集部分中D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的濃度[13],計算分離度。分離度的計算公式為[11]:

    式中,tDP為D-阿洛酮糖保留時間,tDA為D-阿洛糖保留時間,為D-阿洛酮糖色譜峰的半峰寬度,為D-阿洛糖半峰寬,以上單位均為min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 D-阿洛糖產(chǎn)物的定性、定量檢測

    以含RpiB酶的菌體催化D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化,獲得含有D-阿洛糖的產(chǎn)物混合液。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS-MS定性,對比轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品的液相出峰時間及質(zhì)譜圖譜,分析反應(yīng)產(chǎn)物成分。如圖1所示,在(e)產(chǎn)物色譜圖中,有兩個峰分別與(a)中的D-阿洛糖標(biāo)樣及(c)中的D-阿洛酮糖標(biāo)樣色譜出峰時間 相 對 應(yīng) ;且 對 應(yīng) 時 間 出 峰 處 的 MS-MS 圖 譜 ,(f)與(b)中D-阿洛糖標(biāo)樣、(g)與(d)中D-阿洛酮糖標(biāo)樣的MS-MS譜圖碎片相一致。因此,可以判定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中確實存在D-阿洛糖、D-阿洛酮糖兩種組分,即生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛糖的產(chǎn)物與底物,且根據(jù)色譜定量結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中兩者的比例是25∶75,與其他文獻(xiàn)[3]報道的RpiB催化D-阿洛糖生成的酶反應(yīng)產(chǎn)物平衡比例較為接近。

    2.2 等電點測定及產(chǎn)物預(yù)處理

    重組RpiB等電點的計算值為6.49,而根據(jù)IPG預(yù)制膠條的線性梯度計算出來的RpiB的等電點為6.3,說明該酶的等電點在中性偏酸的位置。在等電點沉淀去蛋白的時候,以鹽酸調(diào)節(jié)產(chǎn)物混合液的pH至6.3~6.5之間時出現(xiàn)明顯混濁,加熱處理后出現(xiàn)大量沉淀;與同不調(diào)節(jié)pH并直接進(jìn)行加熱處理的產(chǎn)物混合液相比,蛋白沉淀增加顯著。本轉(zhuǎn)化反應(yīng)中運用的RpiB酶耐熱性較好,轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在較高溫度下進(jìn)行,提高了轉(zhuǎn)化效率且不易受微生物污染。因此,不同于其他酶高溫處理后即可變性沉淀,在產(chǎn)物處理的時候,必須結(jié)合等電點沉淀和高溫處理,才能達(dá)到滿意的蛋白去除效果。同時,調(diào)節(jié)反應(yīng)產(chǎn)物pH到中性偏酸后再進(jìn)行加熱處理,也可避免單糖在偏堿性環(huán)境中加熱生成較多的副產(chǎn)物。

    2.3 糖液的離子交換樹脂分離

    2.3.1 溫度對分離效果的影響 根據(jù)HPLC測定結(jié)果,D-阿洛糖先于D-阿洛酮糖洗脫下來。糖液濃度與洗脫體積進(jìn)行Gause擬合,計算兩者的分離度。如圖2所 示 ,進(jìn) 樣 量 為 12mL,流 速 為1mL/min,柱 溫 為55、60、65℃時,分離度分別為1.01、1.09和1.01,可見60℃時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離效果較好,在后續(xù)實驗中采用此柱溫條件。

    2.3.2 進(jìn)樣量對分離效果的影響 采用流速1mL/min,柱溫60℃的分離條件,考察進(jìn)樣量對分離效果的影響。由圖3可知,進(jìn)樣量為4、8、12mL時對應(yīng)的分離度分別為1.76、1.51和1.13。在固定填料體積的情況下,進(jìn)樣為4mL時的分離效果較好,上樣量增加,加大了分離柱的負(fù)荷,糖之間的分離度下降。進(jìn)樣體積8mL時,分離效果稍有下降,但是一次進(jìn)樣量提高了1倍,產(chǎn)品量較多而對純度要求不高時可以考慮使用該條件。

    2.3.3 洗脫速率對分離效果的影響 柱溫為60℃、進(jìn)樣體積為4mL時,不同洗脫速率下D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線如圖4所示。結(jié)果顯示,洗脫速率為0.5、1、2mL/min時,分離度分別為1.45、1.76和1.37,1mL/min為最佳洗脫速率,在此條件下可以分離得到純度90%以上的D-阿洛糖。

    圖1 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS-MS圖譜Fig.1 LC-MS-MS profile of main products in the reaction mixture

    圖2 不同柱溫時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.2 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different temparatures

    3 結(jié)論

    利用重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib,以D-阿洛酮糖為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,LC-MS-MS檢測,獲得了D-阿洛糖、D-阿洛酮糖兩者比例為25∶75的產(chǎn)物混合液。針對重組RpiB耐熱性好,僅用高溫處理反應(yīng)液去蛋白效果不理想的情況,本研究通過等電聚焦電泳測得重組酶的等電點為6.3,在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了等電點沉淀結(jié)合熱處理法去除反應(yīng)液里的蛋白,取得了較好的效果。建立了DTF-Ca2+型離子交換樹脂分離D-阿洛糖、D-阿洛酮糖的方法,分離得到了純度90%以上的D-阿洛糖,為大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖提供了技術(shù)支持。DTF-Ca2+型離子交換樹脂分離D-阿洛糖的具體條件為:填料180mL,帶恒溫夾套的層析柱長1m,內(nèi)徑1.6cm,去離子水為流動相,進(jìn)樣量為4mL,洗脫速率為1mL/min流速,柱溫為60℃。

    圖3 不同上樣體積時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.3 Seperation curve of D-allose and D-psicose with different loading volume

    圖4 不同洗脫速率時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.4 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different flow rate

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    Separation and purification of D-allose produced by biotransformation

    FENG Zai-ping1,2,MU Wan-meng1,JIANG Bo1,*,ZHANG Tao1,XUE Dong3
    (1.The State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China;3.Taiji Group Zhejiang Dongfang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shaoxing 312000,China)

    The anticancer rare sugar D-allose was converted from D-psicose by E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib. The LC-MS/MS results showed that 25%of D-psicose was converted to D-allose in the reaction product mixture.The pI of the recombinant protein was 6.3 determined by isoelectrofocusing and was successfully applied in isoelectric precipitation.The methods of separation and purification of D-allose was established according to DTF-Ca2+cation exchange chromatography with a flow rate of 1mL/min,column temperature at 60℃ and the loading volume of 4mL.

    D-allose;biotransformation;isoelectric precipitation;purification

    TS202

    A

    1002-0306(2014)22-0304-05

    10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.058

    2014-02-27

    馮再平(1978-),女,博士研究生,講師,研究方向:食品生物技術(shù)。

    * 通訊作者:江波(1962-),男,博士,教授,研究方向:酶在食品生物制造中的應(yīng)用。

    國家自然科學(xué)基金項目(21276001,31171705);紹興市科技計劃項目(2013A23002)。

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