消栓腸溶膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠遠(yuǎn)隔腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及凋亡蛋白表達(dá)的影響

王雅麗，張寧，劉菁，吳曦，王蕾，趙暉

大腦中動(dòng)脈栓塞后遠(yuǎn)離梗死灶的相關(guān)腦區(qū)在亞急性期也會(huì)發(fā)生病理改變，目前認(rèn)為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致遠(yuǎn)隔部位損害的重要因素[1]。腦缺血缺氧后，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)多種形式的氧化性脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷，如不及時(shí)修復(fù)，則可啟動(dòng)凋亡程序。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cystein-aspartate protease 3，caspase3）是細(xì)胞凋亡過(guò)程的執(zhí)行蛋白酶，多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）為最主要的底物，Caspase-3因降解PARP，而被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期分子標(biāo)志[2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種形式的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)，在繼發(fā)性腦組織損傷中的作用受到了普遍關(guān)注[3]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，是其活化和增殖的標(biāo)志物之一[4]。通過(guò)各種有效手段保護(hù)缺血遠(yuǎn)隔部位，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?，阻斷凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)分子的活化對(duì)卒中康復(fù)具有重要意義。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療缺血性卒中的代表方[5]，消栓腸溶膠囊以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為基礎(chǔ)，依托現(xiàn)代定量生物萃取工藝制備的中成藥制劑，本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈栓塞模型從星形膠質(zhì)細(xì)胞活化以及Caspase-3、PARP的表達(dá)變化，探討消栓腸溶膠囊保護(hù)缺血遠(yuǎn)隔腦區(qū)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重為300～350 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證號(hào)：SYXK（JING）2010-0020。實(shí)驗(yàn)條件下自然飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器 消栓腸溶膠囊，三門(mén)峽賽諾維制藥有限公司（批號(hào)20130407）；腦心通膠囊，陜西步長(zhǎng)制藥有限公司（批號(hào)Z20025001）；兔抗GFAP單克隆抗體，北京中杉金橋公司（13114A06）；兔抗Caspase-3單克隆抗體，abcam公司（ab4051）；兔抗PARP單克隆抗體，abcam公司（Lot#784578）；山羊抗兔IgG/DylightTM488，北京中杉金橋公司（96184）；山羊抗兔IgG/Alexa Fluor 594，北京中杉金橋公司（103320）；羊血清工作液，北京中杉金橋公司（ZLI-9021）；大小鼠抓力測(cè)試儀（YLS-13A，山東科學(xué)技術(shù)設(shè)備站）；Eclipse生物顯微鏡（Nikon，日本）；圖像采集分析系統(tǒng)（NIS-Elements Basic Research，日本）；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠中動(dòng)脈栓塞模型制備 參照文獻(xiàn)[6]線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）永久性缺血模型。大鼠麻醉后，仰臥位固定，在頸總動(dòng)脈分叉下方剪一切口，將栓線（直徑0.265 mm，長(zhǎng)4 cm）置于頸內(nèi)動(dòng)脈18 mm，扎緊動(dòng)脈殘端，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分支，不閉塞大腦中動(dòng)脈。術(shù)中、術(shù)后室溫嚴(yán)格控制在24～25℃，大鼠體溫維持在36.5～37.5℃。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)明顯左側(cè)偏癱體征（不能完全伸展左前肢、行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈者）納為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2 分組與給藥 根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體臨床等效劑量換算關(guān)系確定消栓腸溶膠囊和腦心通膠囊的給藥劑量。實(shí)驗(yàn)大鼠共計(jì)90只隨機(jī)分為6組，每組15只：假手術(shù)組、模型組、消栓腸溶膠囊（420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg）3個(gè)劑量組和腦心通膠囊600 mg/kg組。造模后2 h給藥組大鼠灌胃給藥1次，造模24 h再次灌胃給藥，連續(xù)給藥15 d，每天1次。假手術(shù)組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

1.2.3 大鼠抓握力量檢測(cè) 參照YLS-13A大小鼠抓力測(cè)定儀使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抓握力量檢測(cè)，大鼠雙前肢抓住拉力測(cè)試儀的拉力橫桿，測(cè)試者左手先固定拉力板，右手向后拉住鼠尾，松開(kāi)左手，右手向后拉拽大鼠身體，大鼠為了不從橫桿滑落會(huì)抓握橫桿不放，直至滑落，讀取使大鼠滑脫的最大拉力值，每只大鼠測(cè)2次，取平均值。

1.2.4 取材與標(biāo)本處理 缺血15 d后，各組隨機(jī)取4只大鼠，麻醉后，先用300 ml生理鹽水快速左心室灌注沖洗，再進(jìn)行4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，恒定灌注時(shí)間60 min，待固定充分后，開(kāi)顱取腦，切取視交叉后4 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規(guī)石蠟包埋，切片染色。

1.2.5 免疫熒光組織化學(xué)染色 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）高熱修復(fù)抗原20 min，10%羊血清封閉1 h，一抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（抗體稀釋1∶200）、PARP（抗體稀釋1∶80）、Caspase-3（抗體稀釋1∶90），于濕盒中4℃孵育40 h。二抗山羊抗兔（抗體稀釋1∶800），室溫孵育2 h后，0.01 mol/L PBS洗滌，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)封片。

1.2.6 圖像處理 在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)470/490 nm條件下，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。在激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)540/580 nm條件下，PARP和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光。NISElements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)采集每張切片右側(cè)（缺血側(cè)）海馬區(qū)相互不重疊的3個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)；對(duì)每個(gè)視野GFAP、PARP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行分析，以積分光密度（integrated optical density，IOD）反映陽(yáng)性表達(dá)的免疫強(qiáng)度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，大鼠抓握力量檢測(cè)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析，免疫熒光染色圖像分析數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 消栓腸溶膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠前肢抓握力量的影響 造模后3 d、7 d、12 d和15 d，各組大鼠前肢抓握力量之間差異明顯（F=6.432，P=0.000；F=3.345，P=0.011；F=2.744，P=0.029；F=3.286，P=0.012），模型組和假手術(shù)組大鼠的前肢抓握力量之間差異具有顯著性（P均＜0.01）；造模后7 d，消栓腸溶膠囊420 mg/kg組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05）；造模后12 d，消栓腸溶膠囊140 mg/kg組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05）；造模后15 d，消栓腸溶膠囊420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg組和腦心通膠囊組大鼠前肢抓握力量較模型組增加，差異具有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）（表1）。

2.2 消栓腸溶膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬GFAP表達(dá)的影響 缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白GFAP表達(dá)增強(qiáng)，胞體肥大，有多個(gè)短至中等長(zhǎng)度的增粗突起。圖像分析結(jié)果顯示，各組大鼠的海馬GFAP表達(dá)之間差異有顯著性（F=9.744，P=0.000）（圖1）。模型大鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)（P＜0.01）。消栓腸溶膠囊420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg 3個(gè)劑量組及腦心通組大鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性表達(dá)較模型組減弱（P＜0.01）（表2）。

表1 各組大鼠前肢抓握力量的比較（

表1 各組大鼠前肢抓握力量的比較（

注：與模型組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01

組別 N（例） 3 d 7 d 12 d 15 d假手術(shù)組 8 1448.45 116.83消栓腸溶膠囊420組 9 827.46 145.10**模型組 10 935.92 309.29** 1207.05233.17** 1173.76120.77** 1205.46 271.72 707.32146.71 700.80145.09 763.00 364.97**消栓腸溶膠囊140組 9 1037.97 388.59 1043.93276.25* 899.02405.53 1114.56 268.50*消栓腸溶膠囊47組 12 919.86 189.15 819.14289.34 972.09330.77* 1023.87 205.46*F值 6.432 3.345 2.744 3.286 P值 0.000 0.011 0.029 0.012 293.41**腦心通膠囊組 8 687.05 272.82 825.00380.42 865.64318.19 1062.18 295.18 858.15357.44 834.21233.96 1013.86

圖1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP的表達(dá) (免疫熒光染色，×400）

2.3 消栓腸溶膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬Caspase-3、PARP表達(dá)的影響 圖像分析結(jié)果顯示，各組大鼠的海馬Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及PARP表達(dá)比較差異有顯著性（F=6.362，P=0.000；F=8.863，P=0.000）（圖2～3）。和假手術(shù)組相比，大腦中動(dòng)脈栓塞模型組大鼠海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，PARP表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；消栓腸溶膠囊（420 mg/kg、140 mg/kg、47 mg/kg）均可不同程度減少海馬Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，下調(diào)PARP表達(dá)，差異較模型組顯著（P＜0.05或P＜0.01）；腦心通膠囊組大鼠PARP陽(yáng)性表達(dá)也較模型組降低（P＜0.01）（表3）。

3 討論

臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦梗死后，遠(yuǎn)離梗死灶的紋狀體、丘腦、黑質(zhì)、海馬、腦干和脊髓均可發(fā)生繼發(fā)性損害，出現(xiàn)低灌注狀態(tài)，神經(jīng)元數(shù)量減少、功能下降和軸突再生減弱[7-8]。氧化性DNA損傷及凋亡過(guò)程的啟動(dòng)是遠(yuǎn)隔腦區(qū)神經(jīng)元損害的重要機(jī)制[9]。本研究顯示：大腦中動(dòng)脈栓塞15 d后，遠(yuǎn)離梗死灶的海馬腦區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，PARP表達(dá)增強(qiáng)。Caspase是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，Caspase-3通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)作用底物PARP蛋白而誘發(fā)凋亡，是啟動(dòng)凋亡過(guò)程的重要“執(zhí)行者”。PARP為真核細(xì)胞內(nèi)具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基催化活性的蛋白酶，作為重要的DNA修復(fù)酶，PARP可識(shí)別DNA單鏈斷裂位點(diǎn)，當(dāng)DNA少量損傷時(shí)，PARP可修復(fù)DNA單鏈及雙鏈斷裂，維持基因組的完整性。當(dāng)DNA大量損傷時(shí)，PARP持續(xù)激活可耗竭細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP，降低神經(jīng)細(xì)胞抗氧化損傷能力，激活凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[10-11]。因此，PARP蛋白表達(dá)水平反映了DNA單鏈損傷情況及細(xì)胞修復(fù)能力[12]。本研究結(jié)果提示大腦中動(dòng)脈栓塞雖不直接影響海馬區(qū)的血液供應(yīng)，但可造成海馬神經(jīng)細(xì)胞DNA氧化損傷，Caspase-3/PARP凋亡信號(hào)激活。

表3 消栓腸溶膠囊對(duì)海馬Caspase-3、PARP表達(dá)的影響（

注：PARP：多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶；Caspase-3：半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶3；與模型組比較，*：P＜0.05，**：P＜0.01

組別 N（例） PARP積分光密度 Caspase-3細(xì)胞數(shù)（個(gè)）/mm2假手術(shù)組 4 4889.54 1452.38** 6.45 1.86**模型組 4 8378.45 1220.79 11.46 2.57消栓腸溶膠囊420組 4 6097.10 1887.49** 7.67 2.35**消栓腸溶膠囊140組 4 6426.01 1631.63** 8.58 1.83**消栓腸溶膠囊47組 4 5341.56 1518.64** 9.67 2.64*腦心通膠囊組 4 5600.11 1411.69** 9.67 1.94 F值 8.863 6.362 P值 0.000 0.000

圖2 各組大鼠海馬區(qū)PARP的表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

圖3 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持腦缺血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)元存活等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈栓塞后，海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP表達(dá)明顯增強(qiáng)。Block等[13]發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血后，丘腦、黑質(zhì)網(wǎng)狀部、海馬和脊髓等缺血遠(yuǎn)隔部位出現(xiàn)以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的炎癥改變，與本研究結(jié)果相似。

過(guò)度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中還原型輔酶活性增高，產(chǎn)生大量NO，影響DNA修飾，可促使神經(jīng)元損傷和凋亡[14]。同時(shí)，增生的膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞毒性因子，如白細(xì)胞介素1-β（interleukin，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase，COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase，iNOS），這些細(xì)胞因子相互作用，既可通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的相應(yīng)受體刺激其分裂和增生，形成膠質(zhì)瘢痕，又可參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡[15]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為臨床治療缺血性卒中的常用有效復(fù)方，其藥理作用主要環(huán)節(jié)包括：降低腦組織的耗氧量，提高腦組織對(duì)缺血缺氧刺激的耐受性，抗自由基損傷，抑制炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，降低興奮性氨基酸毒性，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16-18]。消栓腸溶膠囊以該方為基礎(chǔ)，通過(guò)現(xiàn)代工藝技術(shù)制備而成，既解決了湯劑煎煮、攜帶不便的問(wèn)題，又可對(duì)其制劑質(zhì)量進(jìn)行有效的控制。本研究結(jié)果顯示消栓腸溶膠囊可促進(jìn)腦缺血大鼠肢體功能恢復(fù)，同時(shí)可減輕大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨潭龋种艭aspase-3/PARP信號(hào)分子的活化。

目前治療缺血性卒中的有效藥物治療為溶栓治療，但溶栓存在安全窗的時(shí)間限制。眾多的神經(jīng)保護(hù)劑，通常在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段有效而到臨床應(yīng)用則無(wú)效[19]。神經(jīng)保護(hù)劑的研究困惑引發(fā)了科研工作者對(duì)卒中治療策略的深層次思索[20]。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，任何致神經(jīng)元損傷的因素均可同時(shí)損傷膠質(zhì)細(xì)胞，后者的一系列病理改變會(huì)加劇神經(jīng)元損傷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨枰諧aspase-3、PARP凋亡信號(hào)分子激活，保護(hù)缺血遠(yuǎn)隔腦區(qū)，為臨床上治療卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究存在的主要不足是目前尚不清楚GFAP、Caspase-3/PARP凋亡信號(hào)在缺血遠(yuǎn)隔部位的變化規(guī)律，因此無(wú)法判斷消栓腸溶膠囊調(diào)控GFAP、Caspase-3、PARP表達(dá)的時(shí)間窗，在后續(xù)研究中，本課題組將制作不同缺血時(shí)間點(diǎn)的永久性大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察GFAP、Caspase-3、PARP蛋白在缺血遠(yuǎn)隔部位的表達(dá)，分析消栓腸溶膠囊的調(diào)控作用，明確星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與細(xì)胞凋亡信號(hào)啟動(dòng)的關(guān)系，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)消栓腸溶膠囊的治療作用。目前認(rèn)為腦血流量不足、軸突退行性改變、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常等因素均與遠(yuǎn)隔腦區(qū)的損害關(guān)系密切[22]。此外，消栓腸溶膠囊作為中藥復(fù)方，具有多成分、多靶點(diǎn)的治療作用特點(diǎn)，本研究結(jié)果僅提示消栓腸溶膠囊可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，Caspase3/PARP蛋白激活減輕遠(yuǎn)隔腦區(qū)損傷。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步從氧自由基代謝、營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)以及軸突再生等多個(gè)環(huán)節(jié)探討消栓腸溶膠囊對(duì)遠(yuǎn)隔腦區(qū)的保護(hù)作用機(jī)制。

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【點(diǎn)睛】

本研究發(fā)現(xiàn)消栓腸溶膠囊可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞異常活化及Caspase-3、PARP表達(dá)，保護(hù)缺血遠(yuǎn)隔腦區(qū)，改善缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷男袨閷W(xué)功能