百草枯對肺組織細胞凋亡的影響

白 雪，盛英杰(綜述)，戢新平(審校)

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1急診科， 2第二呼吸內(nèi)科,沈陽 110004)

百草枯(Paraquat，PQ)又名對草快，其20%的溶液稱克無蹤，化學(xué)名為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽，分子式C12H14N2Cl2，是一種有機雜環(huán)類觸殺、滅生型高毒性除草劑。百草枯接觸土壤后迅速失活，對環(huán)境無污染，其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已有100多年的歷史。人類誤服百草枯后，無特效解毒劑，中毒死亡率極高，其主要臨床癥狀早期為多臟器功能衰竭，后期不可逆性肺纖維化。

百草枯具有與二胺、多胺及二胺二硫胱胺類似的結(jié)構(gòu)，因而可與胺類物質(zhì)競爭細胞膜上能量依賴性多胺攝取受體，進而被細胞攝取。這種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要存在于肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細胞及Clara細胞中[1-2]，巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及核間質(zhì)細胞無此系統(tǒng)[3]。百草枯的選擇性聚集導(dǎo)致肺內(nèi)濃度是血液濃度的10～90倍[4]。

1 百草枯對肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞的影響

研究發(fā)現(xiàn)，百草枯最先損傷肺泡Ⅰ型上皮細胞，后導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細胞水腫變性、肺毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，血管通透性增加[5]。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn),百草枯可誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細胞凋亡，而姜文等[7]發(fā)現(xiàn)百草枯可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡，提示細胞凋亡參與百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷。

百草枯誘導(dǎo)肺泡上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞凋亡可能與下列因素有關(guān)：①氧化損傷。百草枯二價陽離子(PQ2+)+還原性輔酶Ⅱ→PQ++輔酶Ⅱ，PQ+進入細胞內(nèi)，PQ++分子氧→PQ2++超氧陰離子(O2-)，O2-在超氧化物歧化酶的作用下，形成過氧化氫(H2O2)，H2O2在Fe2+催化的Fenton型Haber-Weiss反應(yīng)中形成毒性更強的自由基，如羥自由基(OH-)[8],上述反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基(如O2-、H2O2、OH-等)誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。②鈣穩(wěn)態(tài)失衡。曹鈺等[9]向小鼠腹腔內(nèi)注射百草枯，觀察不同時間點肺組織細胞內(nèi)鈣離子濃度變化及肺損傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性組相比，肺組織細胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的濃度顯著升高，以第2～4日明顯。百草枯中毒時，可出現(xiàn)細胞內(nèi)及線粒體內(nèi)鈣超載，隨后發(fā)生的一系列凋亡改變，參與了肺組織細胞凋亡機制的形成[10]。③線粒體損傷。線粒體是細胞的“發(fā)電廠”，它參與了三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的傳遞。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定是細胞維持正常生理功能的前提，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)具有調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的作用。PTP屬于Ca2+依賴性電壓感受器，正常情況下，絕大多數(shù)PTP處于關(guān)閉狀態(tài)。Costantini等[11]發(fā)現(xiàn)，百草枯可使PTP電壓感受器上的二硫基化合物氧化，誘導(dǎo)PTP大量開放，同時百草枯誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體膜電位下降，PTP進一步開放，線粒體通透性增大，從而誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生。

1.1死亡受體活化途徑 孔慶福等[12]、胡軍利等[13]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細胞早期產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，TNF-α通過與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)結(jié)合，一方面活化胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白，激活下游反應(yīng)，觸發(fā)細胞凋亡；另一方面激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),NF-κB是一類具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白因子，正常情況下NF-κB位于細胞胞質(zhì)內(nèi)，與核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(inhibitors of kappa B，IκB)結(jié)合，使NF-κB處于無活性狀態(tài)。當細胞因子(如TNF-α)、氧自由基刺激后，NF-κB與IκB解離，NF-κB進入細胞核，啟動下游靶蛋白(包括TNF-α、白細胞介素6、白細胞介素8等)合成，TNF-α合成后反過來進一步激活NF-κB，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致組織細胞嚴重損傷[14-15]。

1.2線粒體途徑 Takeyama等[16]將表達野生型p53的人肺上皮樣細胞系L132與缺乏p53基因的人早幼粒細胞性白血病細胞系U937分別暴露于低濃度的百草枯培養(yǎng)液中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)L132細胞系中p53大量表達，處于S期的細胞百分比明顯減少，說明細胞由G1期進入S期受阻；單細胞凝膠電泳顯示單鏈DNA斷裂；U937細胞系中DNA雖然受損，但處于S期的細胞百分比幾乎無明顯變化，顯示出對百草枯的抵抗力。該實驗說明百草枯可能通過p53蛋白的積累誘導(dǎo)細胞凋亡。Dinis-Oliveira等[17]研究表明，百草枯通過激活多條通路誘導(dǎo)肺組織的細胞凋亡，其中p53、轉(zhuǎn)錄激活蛋白呈時間依賴性表達，參與細胞凋亡調(diào)控。Yang等[18]將多巴胺能SY5Y細胞經(jīng)百草枯處理48 h后，測定p53的表達及線粒體內(nèi)凋亡途徑標志物發(fā)現(xiàn)，百草枯通過p53參與線粒體內(nèi)途徑誘導(dǎo)人神經(jīng)母細胞瘤SY5Y細胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族成員與細胞凋亡關(guān)系密切，包括抗凋亡Bcl-2亞族和促凋亡Bax亞族、BH3亞族等。細胞是否發(fā)生凋亡及其嚴重程度取決于Bcl-2/Bax比值的變化，馬玉騰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達均增高，但Bcl-2增高幅度低于Bax，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降，肺組織細胞凋亡增加。Fei等[20]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯刺激Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(BH3 interacting domain protein 3，Bid)、促凋亡調(diào)節(jié)蛋白BNIP3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein interacting protein 3)及Noxa蛋白呈高濃度表達，Bak、BNIP3及Noxa基因沉默可以保護細胞免受百草枯的毒性，該實驗證實Bcl-2蛋白家族成員參與百草枯誘導(dǎo)的細胞凋亡的發(fā)生。

百草枯可造成線粒體膜電位下降，PTP大量開放，導(dǎo)致細胞凋亡啟動因子(如細胞色素C、凋亡酶激活因子、細胞凋亡誘導(dǎo)因子)從線粒體內(nèi)釋放，激活半胱氨酸蛋白酶家族中的胱天蛋白酶(caspase)9和caspase-3，caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，caspase-3的激活可以看作是細胞凋亡的標志[21]。Caspase-3激活后誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。Rincheval等[22]還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Bcl-2和caspase抑制劑并不能抑制百草枯誘導(dǎo)的細胞凋亡，推斷百草枯可能還通過其他途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。張志堅等[23]通過對百草枯中毒大鼠腎組織中caspase-3表達的研究發(fā)現(xiàn)，百草枯染毒組中caspase-3蛋白的表達隨時間推移逐漸增多，推測百草枯中毒后腎臟損傷與細胞凋亡有一定的關(guān)系。González-Polo等[24]將小腦顆粒細胞置于低濃度百草枯中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體上細胞色素C水平顯著減少，而水解蛋白酶和caspase-3活性增加，DNA裂解片段增加，細胞凋亡增強。

與此同時，Mohammadi-Bardbori等[25]發(fā)現(xiàn)百草枯的氧化還原反應(yīng)還可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，間接引起細胞凋亡的發(fā)生。

1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑 死亡受體活化以及線粒體損傷途徑是細胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動的細胞凋亡途徑是近10年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡有其獨特的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶和感受蛋白具有特異性。

Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯處理24 h后的大鼠肺泡上皮細胞系L2中，細胞生存能力顯著下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號因子和蛋白(如糖調(diào)節(jié)蛋白78、生長停滯及DNA損傷基因)表達水平顯著增高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與了百草枯誘導(dǎo)的肺組織細胞凋亡。該研究同樣證實百草枯提高了caspase-3及caspase-7的活性，促進了Bax、Bak、p53蛋白表達，抑制了Bcl-2的基因表達。

綜上所述，百草枯可通過死亡受體活化途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肺組織細胞凋亡。

2 百草枯對多型核中性粒細胞的影響

百草枯對多型核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)是機體抵御外來病原體的第一道屏障，當發(fā)生輕微炎性反應(yīng)時，外周血中的PMN黏附于血管壁并游出至炎癥部位，完成吞噬、殺菌作用后即發(fā)生凋亡，不引起組織細胞損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，當肺組織炎性因子大量釋放、Ca2+濃度升高時，PMN凋亡受到抑制，凋亡延遲，導(dǎo)致PMN處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而釋放大量毒性物質(zhì)，造成組織細胞損傷[26-27]。

劉建輝等[28]在大鼠腹腔注射百草枯，建立急性肺損傷動物模型，檢測肺泡灌洗液中PMN凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMN的凋亡率顯著下降，染毒第3日凋亡率最低；應(yīng)用NF-κB抑制劑(二硫代氨基甲酸吡咯烷)可促進PMN凋亡，推測百草枯通過多條通路誘導(dǎo)NF-κB激活，從而抑制PMN的凋亡，延長PMN的生存時間。除此之外，有學(xué)者還認為PMN的凋亡延遲可能與caspase-3和caspase-9的活性降低及線粒體膜電位持續(xù)降低有關(guān)[29]。

3 百草枯對肺泡巨噬細胞的影響

百草枯對肺泡巨噬細胞所產(chǎn)生的細胞毒性呈時間依賴性，百草枯中毒早期肺泡內(nèi)大量炎性細胞聚集，以肺泡巨噬細胞為主。肺泡巨噬細胞合成并釋放大量細胞因子、前炎性介質(zhì)、趨化因子以及蛋白水解酶毒性物質(zhì)，造成急性肺損傷、間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)出血，而后肺泡巨噬細胞自身凋亡增加，吞噬能力下降，導(dǎo)致凋亡的中性粒細胞不能及時被清除，產(chǎn)生遲發(fā)性壞死，加重炎性反應(yīng)的發(fā)生[30]。

4 小 結(jié)

大量研究顯示細胞凋亡參與了百草枯所致的急性肺損傷的發(fā)生過程，由于肺泡上皮細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡增加，一方面導(dǎo)致肺泡上皮細胞大量丟失，基膜受損，肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡塌陷，肺泡上皮表面的離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)遭到破壞，肺泡間隙水電解質(zhì)紊亂，微血管通透性增高，引起肺水腫發(fā)生；另一方面，有學(xué)者認為正是由于肺泡上皮細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞缺失，導(dǎo)致肺間質(zhì)成纖維細胞代償性增生，發(fā)生過度纖維增殖修復(fù)反應(yīng)，從而造成不可逆的肺纖維化形成。同時，PMN聚集和凋亡延遲進一步加重了肺組織及細胞的損傷。

因此，靶向抑制肺泡上皮細胞及肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡以及促進PMN凋亡可能減輕急性肺損傷，甚至阻止肺纖維化的發(fā)生。

[1] 劉峰,菅向東,尚波,等.急性百草枯中毒肺損傷機制及治療研究進展[J].毒理學(xué)雜志,2011,25(5):380-383.

[2] Shimada H,Hirai K,Simamura E,etal.Paraquat toxicity induced by voltage-dependent anion channel 1 acts as an NADH-dependent oxidoreductase[J].J Biol Chem,2009,284(42):28642-28649.

[3] 劉鵬,梁宇光,何躍忠,等.百草枯中毒的基礎(chǔ)研究及救治進展[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2010,23(5):364-366.

[4] 韓繼媛,程志強.淺談百草枯中毒發(fā)病機制的研究現(xiàn)狀[J].臨床急診雜志,2010,11(2):65-67.

[5] 白光興,李晉,徐貴森,等.大劑量百草枯中毒對大鼠肺損傷的病理觀察[J].四川醫(yī)學(xué),2011,32(4):466-467.

[6] Chen YW,Yang YT,Hung DZ,etal.Paraquat induces lung alveolar epithelial cell apoptosis via Nrf-2-regulated mitochondrial dysfunction and ER stress[J].Arch Toxicol,2012,86(10):1547-1558.

[7] 姜文,何慶.百草枯誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡實驗研究[J].四川醫(yī)學(xué),2010,31(2):158-160.

[8] Yasaka T,Okudaira K,Fujito H,etal.Further studies of lipid peroxidation in human paraquat poisoning[J].Arch Intern Med,1986,146(4):681-685.

[9] 曹鈺,董玉龍,胡海,等.鈣穩(wěn)態(tài)失衡在百草枯中毒肺損傷中的作用[J].四川醫(yī)學(xué),2005,26(7):741-743.

[10] 郭榮球,李亞林.鈣穩(wěn)態(tài)失衡與細胞凋亡的研究現(xiàn)狀[J].邵陽學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版,2005,2(2):124-125.

[11] Costantini P,Petronilli V,Colonna R,etal.On the effects of paraquat on isolated mitochondria.Evidence that paraquat causes opening of the cyclosporin A-sensitive permeability transition pore synergistically with nitric oxide[J].Toxicology,1995,99(1/2):77-88.

[12] 孔慶福,張華,王麗,等.急性百草枯中毒早期器官損害與細胞因子的變化[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2010,17(3):159-162.

[13] 胡軍利,石漢文,田英平,等.核因子-κB及腫瘤壞死因子-α在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2011,29(1):44-48.

[14] 梁衛(wèi)江,張萬岱.腫瘤壞死因子誘導(dǎo)細胞凋亡的信號傳導(dǎo)機制[J].世界華人消化雜志,2000,8(3):329-331.

[15] 丘創(chuàng)華,侯敢,黃迪南.TNF-α信號傳導(dǎo)通路的分子機理[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2007,23(6):430-435.

[16] Takeyama N,Tanaka T,Yabuki T,etal.The involvement of p53 in paraquat-induced apoptosis in human lung epithelial-like cells[J].Int J Toxicol,2004,23(1):33-40.

[17] Dinis-Oliveira RJ,Sousa C,Remi?o F,etal.Sodium salicylate prevents paraquat-induced apoptosis in the rat lung.[J].Free Radic Biol Med,2007,43(1):48-61.

[18] Yang W,Tiffany-Castiglioni E.Paraquat-induced apoptosis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells: involvement of p53 and mitochondria[J].J Toxicol Environ Health A,2008,71(4):289-299.

[19] 馬玉騰,郭憲立,高恒波,等.百草枯中毒致大鼠肺組織損傷時氨溴索對肺組織Bcl-2/Bax的表達及細胞凋亡的影響[J].臨床薈萃,2012,27(9):767-769.

[20] Fei Q,McCormack AL,Di Monte DA,etal.Paraquat neurotoxicity is mediated by a Bak-dependent mechanism[J].J Biol Chem,2008,283(6):3357-3364.

[21] Xu J,Wei C,Xu C,etal.Rifampicin protects PC12 cells against MPP+-induced apoptosis and inhibits the expression of an alpha-Synuclein multimer[J].Brain Res,2007,1139:220-225.

[22] Rincheval V,Bergeaud M,Mathieu L,etal.Differential effects of Bcl-2 and caspases on mitochondrial permeabilization during endogenous or exogenous reactive oxygen species-induced cell death: a comparative study of H2O2,paraquat,t-BHP,etoposide and TNF-alpha-induced cell death[J].Cell Biol Toxicol,2012,28(4): 239-253.

[23] 張志堅,周從陽,羅雅娟,等.百草枯中毒大鼠腎臟病理變化及caspase-3的表達[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2011,24(3):179-180.

[24] González-Polo RA,Rodríguez-Martín A,Morán JM,etal.Paraquat-induced apoptotic cell death in cerebellar granule cells[J].Brain Res,2004,1011(2): 170-176.

[25] Mohammadi-Bardbori A,Ghazi-Khansari M.Alternative electron acceptors: Proposed mechanism of paraquat mitochondrial toxicity[J].Environ Toxicol Pharmacol,2008,26(1):1-5.

[26] 何仁忠,朱黎明.中性粒細胞凋亡與肺部疾病的研究進展[J/CD].中華哮喘雜志：電子版,2010,4(6):350-354.

[27] 靳麗妍,朱光發(fā).中性粒細胞活化和上皮細胞凋亡在急性肺損傷發(fā)生中的作用[J].國際呼吸雜志,2010,30(14):873-876.

[28] 劉建輝,孫志平,馬玉騰,等.百草枯中毒致大鼠急性肺損傷時NF-κB抑制劑對中性粒細胞凋亡的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009,38(3):282-284.

[29] Fialkow L,Fochesatto Filho L,etal.Neutrophil apoptosis:a marker of disease severity in sepsis and sepsis-induced acute respiratory distress syndrome[J].Crit Care,2006,10(6): R155.

[30] Takemura Y,Iwasaki Y,Nagata K,etal.Influence of depletion of alveolar macrophages on apoptosis in Candida-induced acute lung injury[J].Exp Lung Res,2005,31(3):307-321.