法舒地爾提高豬缺血誘導心臟死亡供者心保存效果的實驗研究

陳偉民，李 峰，黃達德，陳文廣

（廣東省廣州市第一人民醫(yī)院心胸外科510180）

心臟移植已成為治療終末期心臟病的惟一有效手段。但是供心短缺嚴重制約了心臟移植的進一步發(fā)展。由于腦死亡供者（DBD）日趨匱乏，人們開始尋找DBD以外的供體。更廣意義上的心臟死亡供者（DCD）器官重新得到重視，包括開展DCD心移植的探索［1-5］。近年一種新的藥物Rho-激酶（ROCK）的抑制劑“法舒地爾”在保護器官抗缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）損傷方面，效果顯著［6-7］。本課題旨在探討法舒地爾對豬缺血誘導的DCD心的保護機制及保存效果，為今后人類缺血誘導的DCD供心保護、開發(fā)和利用，提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雜種家豬16只，雄性，體質(zhì)量（28±3）kg，由廣州醫(yī)學院實驗動物中心提供，分為實驗組和對照組各8 只。

1.2 試劑 鹽酸法舒地爾注射液，規(guī)格為30 mg／2 m L，購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司。其他化學試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.3 實驗方法 參照本研究組既往的方法［8-9］進行。

1.3.1 實驗組 （1）動物氯氨酮15～20 mg／kg肌肉注射誘導麻醉；氯氨酮2 mg／kg 間斷靜脈注射、持續(xù)異丙酚4～6 mg·kg-1·h-1 靜脈泵入維持麻醉；維庫溴銨2 mg／kg靜脈注射誘導肌松和0.1 mg ·kg-1 ·h-1 靜脈泵入維持肌松。麻醉成功后氣管切開并插管、固定，呼吸機輔助呼吸，采用容量控制型通氣模式，吸入氧濃度（FiO2）40%～50%，潮氣量（VT）8～10 mL／kg（開胸后12 m L／kg），通氣頻率（F）20～25次／min。進行心電監(jiān)測、鼻咽溫度監(jiān)測。解剖顯露頸靜脈，穿刺置管建立靜脈通道，測定中心靜脈壓；解剖顯露股動脈，穿刺置管，接壓力換能器和心電監(jiān)測儀，監(jiān)測動脈血壓；抽血監(jiān)測動脈血氣（p H 、PO2、PCO2、SO2%、HCT）。正中切口開胸，撐開胸骨，剪開心包，顯露心臟。游離升主動脈、主肺動脈、上腔靜脈、下腔靜脈，稍抬起心尖，顯露冠狀靜脈竇，細針穿刺采血，測定基礎心肌酶；頸靜脈注射肝素（3 mg／kg，要求ACT＞480 s），經(jīng)右心房荷包縫合，盲性插入冠狀靜脈竇逆行插管，引出冠狀動脈血液，量筒測定半分鐘冠狀動脈血流量（×2 為冠狀動脈流量），冠狀動脈血液立即回注入動物血管內(nèi)。經(jīng)左心室心尖部荷包縫合處尖刀戳孔，插入測壓管，接換能器、BIOPAC MP150數(shù)據(jù)放大器及PO-NE-MAH數(shù)字化數(shù)據(jù)采集／左心壓力分析系統(tǒng)，測定左心室各項基礎血流動力學數(shù)據(jù)。

1.3.2 動物放血、建立缺血誘導DCD心模型 經(jīng)主動脈根部插入“Y”灌注針，固定。經(jīng)“Y”灌注針一側(cè)接頭連接右心吸引，開始快速放血，誘導心臟停跳［心臟缺血至完全停跳，歷時（14±4）min］。血液引入人工心肺機儲血器中，加入其他成分（1000 mL 血加入肝素20000 IU、甲潑尼龍琥酸鈉500 mg、青霉素40 萬IU、慶大霉素12 IU、葡萄糖1.1 g、普通胰島素10 IU）進行預充。心臟缺血停跳后（血壓為零，心臟停止跳動或室顫）繼續(xù)室溫下靜置，觀察25 min，完成DCD模型建立。

1.3.3 切心 心臟室溫下靜置25 min 后，迅速將上腔靜脈用絲線兩道高位結(jié)扎，于結(jié)扎線之間切斷上腔靜脈，下腔靜脈上鉗阻斷，高位主動脈阻斷，于主動脈根部灌注含法舒地爾的冷stanford 液（4 ℃，20mL／kg，60mm Hg 灌注），迅速剪斷下腔靜脈作右心減壓；迅速剪開左心耳，行左心減壓?？拷陌嫡厶幥袛嗨杏覀?cè)肺靜脈、左側(cè)肺靜脈；心包腔放置冰泥（保持心臟局部深低溫）。灌注完畢后，在弓部主動脈（左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間）處切斷主動脈，在肺動脈分叉處切斷主肺動脈，切斷心臟后面附著的心包組織，取出心臟，立即置于冷stanford 液（4 ℃）中，心臟灌注插頭插入主動脈，固定，迅速懸掛在langendorff 裝置上（圖1）。該裝置基于心臟langendorff灌注原理，并整合人工心肺機，自行構(gòu)建。人工心肺機儲血器中血，經(jīng)鼓泡肺充分氧合、加溫，主泵將氧合溫血泵至langendorff 灌注裝置儲血瓶中。通過調(diào)整儲血瓶液面高度，達到不同離體心臟灌注壓。由恒溫水浴加溫后，使灌注系統(tǒng)保持恒溫。心臟灌注過程中，冠狀靜脈竇回流血，以右心吸引回收至儲血器中，再次循環(huán)。

1.3.4 供心離體灌注 （1）平衡：供心懸掛在離體灌注裝置上后，開啟離體心臟灌注系統(tǒng)，充分排氣后開放供心灌注通路，開始氧合溫血灌注，心臟復跳（自動復跳，或必要時除顫）。平衡初始，以40 mm Hg 汞柱低壓灌注；復跳成功后，改為常規(guī)60 mm Hg 汞柱壓力灌注。右心室前壁放置一對起搏電極，予150 次／min 起搏；整個灌注實驗過程中，灌注系統(tǒng)恒溫在38.0℃，間斷監(jiān)測血氣（p H、PO2、PCO2、SO2%、HCT）。經(jīng)左心耳置入左心室測壓水囊，接換能器、BIOPAC MP150數(shù)據(jù)放大器及PO-NE-MAH數(shù)字化數(shù)據(jù)采集／左心壓力分析系統(tǒng)，監(jiān)測各項心臟血流動力學指標；量筒收集1 min 冠狀動脈回流血，為冠狀動脈流量（coronary blood flow，CBF）；取冠狀動脈回流血，測定心肌酶；平衡20 min。平衡結(jié)束后，要求HR維持在每分鐘（150±3）次左右、LVEDP 15～25 mm Hg、LVPDP≥90 mm Hg 及CBF保持穩(wěn)定，未達到要求的豬心剔出實驗。（2）冷浸浴原位保存：平衡結(jié)束后，鉗閉主動脈灌注通路，停止心臟氧合血灌注；關(guān)閉心臟起搏器；經(jīng)供心灌注管的側(cè)孔，予單純冷stanford 液再次灌注（4 ℃，10mL／kg，60mm Hg 重力），心臟停跳。同時，將含法舒地爾的冷stanford 液（1 L，4 ℃）加入儲心瓶，供心保留在原位不動（儲心瓶外壁用足量冰屑包埋），作供心原位冷浸浴保存2 h。在此期間，停止恒溫水浴、體外循環(huán)機，氧合器血保持旁路循環(huán)。（3）供心復跳：供心保存結(jié)束后，立即摒棄儲心瓶中的stanford 液，生理鹽水灌洗儲心瓶及下游管道1 次。重新開啟離體心臟灌注系統(tǒng)，開放供心灌注通路，氧合溫血恢復灌注，心臟漸復跳（自動復跳或必要時除顫），模擬臨床上心臟植入吻合成功后，主動脈開放心臟復跳過程。主動脈開放后復灌1 h，停止心臟灌注，取下供心，結(jié)束實驗。

圖1 豬心臟langendorff 灌注裝置

1.3.5 對照組 對照組整個實驗過程中不使用“法舒地爾”（用等量生理鹽水代替），其余同實驗組。

1.4 監(jiān)測指標

1.4.1 心臟血流動力學 缺血前、平衡結(jié)束后、供心保存后的復灌期，持續(xù)監(jiān)測LVEDP、LVPDP、＋dp／dt、-dp／dt、HR。

1.4.2 CBF缺血前、平衡結(jié)束后、供心保存復灌后30 min、復灌后60 min 時點，用量筒測定1 min冠狀動脈血流量，為CBF。

1.4.3 心肌酶測定 缺血前、平衡結(jié)束后、供心保存后的復灌后30 min、復灌后60 min 時點采冠狀靜脈回流血，測定肌酸激酶（creatine，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CKMB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）。使用本院生化室全自動血液生化儀及Beckman Coulter 公司試劑完成測定。

1.4.4 心肌組織含水量 灌注實驗結(jié)束后，取下心臟，取右心室心肌組織約2 g，試紙拭干水分，稱濕質(zhì)量，80℃恒溫干燥24 h，稱干質(zhì)量，按公式計算：心肌組織含水量（%）＝（心肌組織濕質(zhì)量-干質(zhì)量）÷心肌組織濕質(zhì)量×100%。

1.4.5 心肌梗死量（IV）上述心臟切除右心室，保留左心室，垂直左心室縱軸方向切成6 塊切片，標本以1% 氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazoliumchloride，TTC）磷酸緩沖液染色20 min，10% 甲醛固定24 h，參照美國哈佛大學醫(yī)學院BID醫(yī)學中心方法［10］，觀察并測定心肌IV：即將梗死面積描記于專用薄膜上，在PC機上采用圖像處理軟件測量每張切片斷面總面積（total area，TA）及斷面中各小梗死灶面積，計算累積梗死灶面積（infarction area，IA），切片稱質(zhì)量。按下列公式計算出IV：每一切片梗死質(zhì)量（mg）＝｛［上斷面（IA÷TA）］＋［下斷面（IA ÷TA）］×切片質(zhì)量（mg）｝／2；IV＝∑各切片梗死質(zhì)量（mg）／∑各切片質(zhì)量（mg）。

1.4.6 心肌電鏡觀察 取左心室心尖部心肌組織標本（1 mm3大?。?，立即置于4 ℃2.5%戊二醛固定，50%～100%乙醇多級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾染色，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，兩樣本t 檢驗（兩樣本方差有顯著差別，采用t′檢驗），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學指標變化 所有動物均完成實驗，包括達到平衡、保存結(jié)束后成功復蘇。缺血前、平衡后兩組比較，各項心臟血流動力學指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1、2。

表1 缺血前心臟血流動力學（±s）

表1 缺血前心臟血流動力學（±s）

★：P＞0.05，與對照組比較。

組別 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 15±0.5124.7±4.7120±41949±38.61428±48.9實驗組 16±0.3★ 123.9±5.2★ 121±5★ 1972±43.2★1403±44.7對照組★

表2 平衡后心臟血流動力學（±s）

表2 平衡后心臟血流動力學（±s）

★：P＞0.05，與對照組比較。

組別 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 22±2.1109±1.5150±31790±47.31358±40.4實驗組 21±0.2★ 118±0.2★ 150±31803±45.7★1362±36.0對照組★

平衡開始時（實驗組及對照組各1例）以及心臟保存結(jié)束復灌開始時（實驗組2例、對照組3例）供心需除顫復跳。復跳后心肌紅潤，為竇性心律，自主HR為每分鐘128～142 次；所有心臟均給予起搏，每分鐘150 次起搏，轉(zhuǎn)為起搏心律，心臟收縮有力。兩組在復灌后30 min，實驗組心功能優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表3；在實驗結(jié)束時（復灌后60 min），兩組心功能有下降趨勢，但實驗組仍優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表4。

2.2 CBF變化 缺血前、平衡后，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；復灌后30 min、復灌后60 min，實驗組均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表5。

表3 復灌后30 min 心臟血流動力學（±s）

表3 復灌后30 min 心臟血流動力學（±s）

★：P＜0.01，與對照組比較。

組別 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 21±3.9128±3.0150±31780±60.41349±45.0實驗組 17±0.2★ 142±3.6★ 150±32228±48.9★1870±48.5對照組★

表4 復灌后60 min 心臟血流動力學（±s）

表4 復灌后60 min 心臟血流動力學（±s）

★：P＜0.01，與對照組比較。

組別 LVEDP（mm Hg）LVPDP（mm Hg）HR（次／min） ＋dp／dt -dp／dt 35±3.9112±3.1150±31572±56.21144±41.2實驗組 23±0.2★ 138±3.4★ 150±32043±42.5★1782±44.6對照組★

表5 不同時點CBF 測定（±s，m L／min）

表5 不同時點CBF 測定（±s，m L／min）

★：P＜0.01，與對照組比較。

組別 缺血前 平衡后 復灌后30 min復灌后60 min對照組212±21.6204±20.3170±18.6146±16.4實驗組 214±22.7206±21.3198±12.4★ 176±15.4★

2.3 心肌酶 兩組缺血前、平衡后，各項心肌酶指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。復灌后30 min、復灌后60 min，兩組均顯著升高，實驗組升高幅度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 冠狀動脈回流血心肌酶測定

2.4 心肌含水量 對照組（80.3%±1.2%）明顯高于實驗組（77.9%±0.8%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 心肌梗死量 兩組心肌各切片標本，肉眼可見散在、局灶性分布的梗死病灶。對照組（25.0%±0.4%）心肌梗死量明顯高于實驗組（16.0%±0.2%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.6 心肌電鏡觀察 （1）對照組：細胞核橢圓形、不規(guī)則形，核膜清晰，肌纖維排列正常，閏盤、Z 帶欠清晰，線粒體輕度腫脹，部分嵴溶解，糖原顆粒減少（圖3）；（2）實驗組：心肌細胞核呈梭形、長桿狀、橢圓形，核膜清晰，常染色體呈細顆粒狀，異染色體分布在核膜內(nèi)側(cè)，心肌纖維排列有序，閏盤、Z帶清晰可見，肌原纖維間有桿狀線粒體，有豐富糖原顆粒。線粒體均勻排列，可見清晰的線粒體嵴和膜（圖4）。

圖3 對照組電鏡圖像（×10000）

圖4 實驗組電鏡圖像（×10000）

3 討 論

3.1 豬DCD心動物模型的探討（1）豬DCD心離體心臟灌注模型選擇：哺乳動物離體心臟灌注系統(tǒng)的概念，是由Oscar Langendorff［11］在一個多世紀前提出的，在生理學和藥理學的研究中得到廣泛應用。該技術(shù)使研究者在心臟無神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)等影響因素的條件下，可以研究其心功能、HR以及冠狀動脈的特性等。通過升主動脈向冠狀動脈灌注，由于灌流液壓的作用，動脈瓣關(guān)閉，灌流液順勢流入冠狀動脈，從而使心臟維持跳動數(shù)小時。其缺點為“非工作心”，不能改變心臟的前／后負荷做功。心臟只對開放的循環(huán)回路系統(tǒng)泵血。為此，Neely及Morgan［12］在20 世紀60年代提出“工作心”模型，并用于研究氧耗和心肌負荷關(guān)系。本研究重點觀察心肌缺血-再灌注損傷，故仍采用Langendorff“非工作心”模型，其符合本實驗的要求。（2）取心及主動脈插管技巧：盡量留有足夠的主動脈長度，為此，需高位切斷主動脈，以免插灌注管時，插管末端有堵塞冠狀動脈開口可能。因此，本研究均選擇在主動脈弓部（左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間）橫斷主動脈，取出供心，置于stanford 液（4 ℃）后，快速結(jié)扎弓部的頭臂分支血管，主動脈斷端插入主動脈灌注管，結(jié)扎固定，銜接至離體灌注裝置上。（3）判斷供心死亡的標準：以肉眼觀察心臟完全停止跳動（或室顫）為心臟死亡標準，而非心電圖的改變。因心臟停跳早期，心電圖仍可有心電活動，即“電-機械”分離現(xiàn)象。（4）灌注壓力選擇及心麻液使用：本研究體外灌注時，供心在切心前及平衡后需再次停跳時，均采用冷stanford 液（4 ℃）灌注。有實驗表明，切心時不用冷心麻液，結(jié)合在Langendorff 模型上全程采用低壓（40 mm Hg）灌注，反而可提高供心保存質(zhì)量［13］。作者仍認為，切心前使用stanford 液灌注；平衡結(jié)束后需再次停跳時，使用冷stanford 液灌注可使心臟迅速停跳。結(jié)合復跳前短暫控制性低壓（40 mm Hg）灌注，一旦心臟復跳后恢復常規(guī)壓力（60 mm Hg）灌注，在減輕心肌損傷方面應更有效。

3.2 鹽酸法舒地爾對DCD供心的保護效果 （1）法舒地爾是一種蛋白激酶抑制劑，為細胞內(nèi)鈣離子拮抗劑。其抑制的對象ROCK，是一類相對分子質(zhì)量為160 ×103的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可以介導下游一系列蛋白［如：肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）、肌球蛋白磷酸酶（MYPT-1）等］磷酸化／脫磷酸化反應［14］。法舒地爾通過肌球蛋白輕鏈磷酸化，阻斷血管收縮過程的最終階段，擴張血管及抑制血管痙攣；抑制其他縮血管物質(zhì)，阻止Ca2＋內(nèi)流，抑制無Ca2＋存在的條件下腎上腺素或前列腺素所引起的血管收縮反應；增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的形成，抵抗氧自由基，抑制細胞骨架蛋白的降解，具有抗細胞凋亡作用；對中性粒細胞、單核細胞及巨噬細胞的聚集、變形、移動、浸潤和吞噬具有直接的抑制作用，拮抗炎癥因子分泌，發(fā)揮抗炎作用；增加內(nèi)源性NO合成酶（e NOS）的表達，促進NO生成［15］，產(chǎn)生直接擴血管作用。Shibata 等［6］證實，在缺血前及再灌注早期應用法舒地爾，可減輕局限性心肌頓抑模型冠狀動脈阻斷復制中的心肌頓抑損傷；Kobayashi等［7］也證實，使用法舒地爾，可改善UW液冷浸浴保存24 h 后的兔心心功能。再灌注前應用法舒地爾，能夠有效預防內(nèi)皮細胞功能障礙及減輕心肌梗死的發(fā)展。尤其在再灌注早期，缺血的心肌中Rho 的表達明顯上調(diào)和ROCK激酶被激活［16］。本研究中，在stanford 灌注液中添加法舒地爾干預，觀察到兩組在實驗結(jié)束后切取的心肌標本，存在梗死病灶，都為少量、散在的梗死灶改變，但實驗組的梗死量明顯小于對照組。因此，推測在切心前及供心冷保存期間應用法舒地爾具有減輕I-R損傷的作用。（2）心肌酶：復灌后30 min、復灌后60 min 檢測各項心肌酶指標，發(fā)現(xiàn)均明顯升高，實驗組升高幅度顯著小于對照組。由此，推測鹽酸法舒地爾可以減少心肌酶的漏出。（3）CBF：法舒地爾具有強大的血管舒張作用。Yada 等［17］在狗的實驗模型上也觀察到，ROCK抑制劑能擴張血管及增加CBF，且呈劑量依賴性，最大效應劑量為0.1 mg／kg。法舒地爾增加冠狀動脈流量的作用，推測與冠狀動脈血管內(nèi)皮功能得到保存及直接擴血管作用有關(guān)。血管內(nèi)皮功能改善，有助于心肌灌注的改善，以及冷保存期后心肌蓄積的毒性代謝廢物的排出。內(nèi)皮細胞功能受損，表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞釋放的NO下降。NO是由eNOS，以L-精氨酸為底物所合成，其可調(diào)節(jié)血管張力。（4）心功能變化：兩組在失血前各項血流動力學指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。實驗組取心時，已用了法舒地爾，平衡結(jié)束后，與對照組比較，仍未見到血流動力學變化的差異，可能與法舒地爾作用時效性有關(guān)，即此時法舒地爾尚未起效。冷浸浴保存結(jié)束后復灌30、60 min，實驗組各項血流動力學指標明顯優(yōu)于對照組，包括反映心臟舒張功能的指標（LVEDP、-dp／dt）和收縮功能的指標（LVPDP、＋dp／dt）。推測在這些時間點，取心時使用的法舒地爾開始起效，并與冷浸浴保存時使用的法舒地爾產(chǎn)生了疊加效應。（5）法舒地爾介入的“時間窗”：本研究在缺血前不使用法舒地爾，是基于DCD器官獲取的原則，即在這個時段，不應使用任何與獲取器官有關(guān)的，可能加速或?qū)е滤劳龅娜魏嗡幬铮ǔ藛岱?、異丙酚等可降低供者脫離呼吸機時痛苦的藥物，盡管其可能在減輕痛苦同時，也可能存在加速死亡的重疊效應）。盡管有人作鼠無心跳供體心的研究表明，供心缺血開始后，降溫到32 ℃中度低溫，有助于復灌期心功能的恢復［18］，本研究仍采用室溫下放置的方法，不作任何取心前的提前干預措施。且本實驗在供心保存結(jié)束后的復灌期也未使用法舒地爾。因已有資料表明，法舒地爾有較強的擴血管作用，臨床上，主動脈開放后復灌早期使用，有可能導致機體血流動力學不穩(wěn)定，血壓降低，并不推薦使用。綜上所述，本研究只限于在stanford 液切心前心臟灌注，以及stanford液供心保存中使用。

本實驗證明，對stanford 液心臟切心前灌注、stanford 液（4 ℃）供心浸浴保存兩個時段，應用Rho 激酶抑制劑“法舒地爾”進行干預，可控制心肌梗死量，降心肌細胞酶，抑制心肌細胞凋亡，減輕心肌水腫，改善供心冠狀動脈灌注，改善心功能，保存心肌超微結(jié)構(gòu)完整性。提示法舒地爾能夠減輕心肌I-R損傷，提高豬缺血誘導心臟死亡供者心保存效果。

（志謝：感謝本院麻醉科和體外循環(huán)組的大力協(xié)助和支持?。?/p>

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