骨髓間充質干細胞移植對急性肺損傷大鼠的治療作用

廖畫　劉華

[摘要] 急性肺損傷（ALI）是急性呼吸窘迫綜合征的前期表現(xiàn)，嚴重時可發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，具有較高的發(fā)病率及病死率。目前對于ALI的治療主要以機械通氣和對癥治療為主，但病死率仍居高不下。隨著干細胞研究的深入，骨髓間充質干細胞（BMSCs）對ALI的治療作用被逐漸認可。在大量研究的基礎上，本研究歸納了BMSCs通過增殖分化、抑制炎癥反應、免疫調節(jié)等方面治療ALI的機制與特點。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞；急性肺損傷；移植

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] B [文章編號] 1674-4721（2014）01（c）-0188-04

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由非心源性的各種肺內、外因素引起的，呈急性、進行性呼吸衰竭臨床表現(xiàn)的疾病。ALI可由多種不同的病因引起，發(fā)病率與病死率也因病因的差異而有所不同，在疾病的后期能迅速進展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。隨著近年對于干細胞研究的逐漸增加，骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）移植后能增殖分化修復肺組織結構、調節(jié)肺內凋亡機制，抑制炎癥及免疫調節(jié)的能力[2]，越來越受到呼吸疾病研究工作者的重視，有望成為治療ALI的新方法。

1 ALI

1.1 ALI的發(fā)病機制

ALI/ARDS多由相關的臨床疾病引起，可以分為肺內因素和肺外因素。肺內因素包括肺炎、誤吸、挫傷、栓塞、吸入性損傷和缺血-再灌注。肺外因素包括肺外膿毒癥、創(chuàng)傷、燒傷、大量輸血、冠狀動脈旁路移植術、中毒與急性胰腺炎等[3]。病理特征主要有肺泡上皮細胞和肺毛細血管內皮細胞損傷，進而兩者通透性增加，造成彌漫性肺間質水腫，肺泡充滿富含蛋白質的滲出液，約72 h后形成透明膜，導致肺容積減少、肺順應性降低、嚴重的通氣/血流比例失調。臨床上表現(xiàn)為進行性血氧降低和呼吸窘迫，肺部影像學上出現(xiàn)斑片狀以至大片狀的浸潤陰影[4]。

1.2 ALI的診斷

1994年歐美聯(lián)席會議提出了ALI/ARDS的診斷標準[1]，中華醫(yī)學會呼吸病學分會也于2000年提出了我國ALI/ARDS的診斷標準。①有ALI/ARDS的高危因素；②急性起病、呼吸頻數(shù)和（或）呼吸窘迫；③低氧血癥：ALI時動脈血氧分壓（PaO2）/吸入氧分數(shù)（FiO2）值≤300，ARDS時PaO2/FiO2≤200；④胸部X線檢查顯示兩肺浸潤陰影；⑤肺動脈楔壓（PAWP）≤18 mm Hg或臨床上能除外心源性肺水腫。同時符合以上5項條件，可以診斷為ALI或ARDS[5]。

1.3 ALI的流行病學現(xiàn)狀

據(jù)美國華盛頓醫(yī)療中心統(tǒng)計，在美國的重癥監(jiān)護病房（ICU），每年約有190 000例患者診斷為ALI，而在急診科接受機械通氣的非創(chuàng)傷患者中，符合ALI診斷標準的比例為8.7%[6]。在普通呼吸病房中，出現(xiàn)急性肺部浸潤的患者達66%，其中9%的患者符合ALI的診斷標準，2%的患者診斷為ARDS[7]。有研究顯示，1994～2006年，ALI/ARDS的病死率約為43%，與以往相比雖有明顯下降，但仍需要極高度的關注[8]。

1.4 ALI的治療現(xiàn)狀

ALI的臨床治療分為藥物治療和機械輔助治療。藥物治療：皮質類固醇激素、體液管理、神經(jīng)肌肉阻斷劑[9]。機械輔助治療：低潮氣量通氣、呼氣末正壓通氣、高頻通氣與常規(guī)通氣[10-11]。其他輔助治療：預防應激性潰瘍和靜脈血栓，營養(yǎng)支持和治療相關的傷害等[12]。上述治療在挽救和維持患者生命中起著重要的作用，但卻未能大幅度降低病死率，對于ALI的肺泡浸潤、肺泡上皮和毛細血管損壞、肺部及全身的炎癥不能很好地統(tǒng)一兼顧，致使病死率居高不下，急需尋求ALI/ARDS更完善的治療方法。隨著對ALI發(fā)病機制的研究和上述治療并發(fā)癥方法的增加，ALI的治療重點逐漸轉向非機械通氣手段。

2 BMSCs

有研究顯示，BMSCs移植后，能歸巢到肺組織損傷部位，并通過釋放可溶性因子，減輕肺毛細血管內皮的通透性及肺泡水腫、緩解肺部炎癥、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、幫助肺部血管重建等，起到治療ALI/ARDS的效果[13-14]。下面將從三方面介紹BMSCs移植治療ALI大鼠的研究現(xiàn)狀。

2.1 BMSCs歸巢與增殖分化

ALI病理改變發(fā)展過程中，逐漸出現(xiàn)肺泡上皮受損壞死，成纖維細胞增生和膠原沉積。在BMSCs治療ALI的研究中，將β-半乳糖苷酶標記的BMSCs經(jīng)尾靜脈輸入博來霉素引起的大鼠肺損傷模型中，BMSCs可遷移到肺組織，并分化為具有Ⅰ型肺泡上皮的形態(tài)特征及特異性表面標記：T1α和水通道蛋白-5的細胞[15]。Ma等[16]在體外建立了模擬肺部微環(huán)境的培養(yǎng)基，植入BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs能成功分化為具有表面蛋白C（surfactant protein C，SP-C）的人Ⅱ型肺泡上皮細胞特異性表面標志蛋白。將熒光原位雜交技術標志的雄性大鼠的BMSCs在第一時間移植到博來霉素引起的雌性肺損傷大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)雄性大鼠的BMSCs能快速增殖為移植數(shù)目的3倍，同時顯現(xiàn)出Ⅱ型肺泡細胞樣形態(tài)并顯著減輕肺部炎癥和膠原沉積[17]。有研究證明，移植的BMSCs能歸巢到損傷肺組織并增殖分化修復肺部結構，減少肺部結構改變。

2.2 BMSCs對細胞因子的調節(jié)作用

BMSCs可產(chǎn)生肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）[18]，HGF對BMSCs有多重生物學效應。彈性蛋白酶引起的肺損傷大鼠，經(jīng)鼻腔吸入HGF后，可顯著改善肺泡腔的擴大和肺泡壁的破壞。經(jīng)2周的HGF治療后，明顯提高靜態(tài)肺順應性、肺部增殖細胞核抗原（PCNA）和細胞角蛋白-19的水平，提示BMSCs分泌HGF有促肺泡新生和動員干細胞修復損傷的能力[19]，減緩ALI的小氣道閉陷和肺泡萎陷不張。

BMSCs移植的受體大鼠肺泡灌洗液中，可發(fā)現(xiàn)角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）明顯升高。KGF又稱FGF-10，是人體皮下組織細胞分泌的一種堿性蛋白生長因子，特異性地結合到上皮細胞表面的特異受體，經(jīng)過復雜的信號傳遞過程，啟動上皮細胞內參與分裂生長的基因表達，從而刺激上皮組織的新陳代謝。Huh等[20]研究顯示，KGF通過磷酸化蛋白激酶B（Akt/PKB），啟動多種途徑抑制Ⅱ型肺泡上皮凋亡。在機械通氣造成的ALI中，KGF介導BMSCs恢復系統(tǒng)氧合能力和肺順應性，降低全肺水腫程度，減少肺部炎癥、肺組織損傷和恢復肺的結構，同時降低致炎因子TNF-α，提高抗炎因子IL-10[21]。Wang等[22]證明KGF可以提高ALI肺泡對液體的運輸能力，減輕肺部濕/干比。

在木瓜蛋白酶引起的肺氣腫模型中，出現(xiàn)了TNF-α的升高，繼而導致移植的BMSCs分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。VEGF表達于血管內皮表面，能作用于血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖，增加血管的通透性。Zhen等[23]阻斷VEGF信號傳導通路后，發(fā)現(xiàn)肺部細胞凋亡增加，肺氣腫加重，提示VEGF對木瓜蛋白酶損害下的肺部細胞起保護作用。

BMSCs還可以分泌腎上腺髓質素[24]，腎上腺髓質素能增加外周血循環(huán)中的單核細胞和干細胞抗原-1（Sca-1）陽性細胞，吸引循環(huán)中的內源性骨髓干細胞到損傷的肺組織參與修復，并對肺泡上皮和內皮細胞起直接保護作用[25]。

白細胞介素1受體拮抗劑（interleukin 1 receptor antagonist，IL1RN）是由BMSCs其中一組細胞亞群特異分泌的物質，能在體外阻斷依賴T細胞活化分泌的IL-1和抑制活化的巨噬細胞分泌TNF-α，通過抑制IL-1和TNF-α這兩大炎性因子來保護ALI時的肺組織[26]。

IL-10是BMSCs治療ALI中一個重要的細胞因子，主要由Th2細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生；具有抑制前炎癥細胞因子產(chǎn)生，抑制MHC-Ⅱ類分子和B-7分子的表達，抑制T細胞合成IL-2、IFN-γ等細胞因子，促進B細胞分化增殖等作用。BMSCs能通過直接調節(jié)Th2細胞分泌IL-10，或者通過KGF等因子間接調控，起到抗炎效果[20，27]。經(jīng)氣管輸入BMSCs對抗內毒素造成的ALI試驗中，BMSCs能顯著上調IL-10，同時下調TNF-α和巨噬細胞炎性蛋白（monocyte inflammatory protein-2，MIP-2），提高ALI小鼠的生存率[27]。

由此可見，BMSCs可通過釋放可溶性因子抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，調節(jié)細胞因子緩解肺部炎癥，保護肺組織。

2.3 BMSCs對免疫細胞的調節(jié)作用

BMSCs可改變樹突狀細胞（dendritic cell，DC）分泌的細胞因子，使成熟的DC1減少TNF-α的分泌，DC2可增加抗炎因子IL-10分泌；BMSCs同時作用于T細胞，減少Th1釋放INF-γ，Th2增加IL-4的分泌，并且增加Treg細胞的生成，使組織內IL-10增加[28]。BMSCs通過分泌可溶性因子，使IgM、IgG、IgA表達受損，B細胞在抗原依賴期不能與抗原高親和力結合，其表面的CD40不能很好地表達，B細胞與Th細胞特異性結合，用于活化的B細胞減少，致使B細胞不能繼續(xù)分化和發(fā)育為漿細胞。B細胞表面趨化因子受體CXCR4、CXCR5、CXCR7表達受損，對CXCL12、CXCR4配體、CXCL13、CXCR5配體的趨化性顯著下調。BMSCs通過抑制B細胞活化及趨化，能有效減少ALI發(fā)生時體內出現(xiàn)的過度和自我破壞的炎性反應[29]。

3 BMSCs治療ALI的預臨床、臨床實驗

3.1 BMSCs在體外人體組織中的作用

大量的動物實驗提示了BMSCs治療ALI可以從抗水腫、抗凋亡、抗炎癥、免疫調節(jié)出發(fā)，表現(xiàn)出了很高的可行性，而這些治療機制在人體是否具有同樣的作用也受到了重視。用38具不能利用于肺移植的人體肺組織，建立體外血液循環(huán)及呼吸循環(huán)，再具體分組為控制組、LPS肺損傷組、LPS+MSC治療組、LPS+MSC條件培養(yǎng)液治療組，對其肺泡液體清除（AFC）及肺泡液中KGF含量進行比較，結果顯示，異體BMSCs移植或BMSCs條件培養(yǎng)液移植可以明顯減輕肺水腫，改善肺內皮細胞屏障的完整性，使肺泡上皮細胞對液體的運轉能力恢復正常，并認為這是通過KGF介導肺泡液鈉轉運引起的[30]。

3.2 BMSCs移植在活體人體內的治療嘗試

2010年南京一位19歲女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者因出現(xiàn)痰中帶血，迅速進展為進行性呼吸困難和低氧血癥，被診斷為SLE相關的彌漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage，DAH），經(jīng)類固醇激素和免疫球蛋白的沖擊療法后仍無明顯好轉。Liang等[31]為患者進行了臍帶血來源的間充質干細胞（MSCs）異體移植，移植后患者的臨床表現(xiàn)得到迅速改善，影像學及血液學在1周后恢復正常。SLE相關的DAH通常認為與免疫復合物沉積在肺泡毛細血管基底膜，引起基底膜損傷和血管炎相關。該病例的成功治療，提示了MSCs對肺組織的保護作用，但其機制尚未明確。

在ALI/ARDS的治療中，不僅要在疾病的早期對抗其肺水腫、內皮細胞和肺泡細胞的破壞引起的頑固性低氧血癥和呼吸窘迫，還需在后期治療中調節(jié)全身的免疫機制，縮短炎癥持續(xù)期，維護肺組織結構，改善預后。BMSCs在此顯示出的對疾病的多功能調節(jié)，使其受到了極大的關注。然而BMSCs的提取、培養(yǎng)、動物模型的制造，BMSCs與各種細胞因子、炎癥因子、肺組織內源性干細胞、免疫細胞的相互作用還需要進一步的探索，其對于ALI/ARDS的臨床治療也需要更多的基礎研究支持。

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（收稿日期：2013-09-29 本文編輯：林利利）