重組腺相關(guān)病毒質(zhì)量控制的qPCR技術(shù)研究進(jìn)展

肖桂清，楊會(huì)勇，刁勇

（華僑大學(xué) 分子藥物研究院，福建 泉州362021）

重組腺相關(guān)病毒（r AAV）載體是基因治療領(lǐng)域最具前景的載體之一，世界范圍內(nèi)已有100余項(xiàng)r AAV基因藥物已完成或正在進(jìn)行臨床研究，且治療效果顯著，如治療Leber′s先天性黑內(nèi)障［1-3］，以及治療脂蛋白脂酶缺乏癥.除產(chǎn)業(yè)化制備工藝外，r AAV基因藥物的質(zhì)量控制技術(shù)，也是制約其臨床應(yīng)用的因素之一，特別是在缺少準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定r AAV滴度的標(biāo)準(zhǔn)方法［4-7］.當(dāng)前，r AAV滴度測(cè)定所采用的方法按原理的不同可分為生物測(cè)定和物理測(cè)定兩大類.其中生物測(cè)定法包括感染滴度法和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度法，物理測(cè)定法包括病毒顆粒滴度法和基因組滴度法.因r AAV基因組滴度（GC）理論上與其顆粒滴度（P）和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（TU）成線性關(guān)系，且測(cè)定簡(jiǎn)便，所以成為最常用的滴度指標(biāo)［8］.qPCR是常用的r AAV基因組滴度測(cè)定法［9］，但傳統(tǒng)的qPCR法存在適用范圍窄［10］、易產(chǎn)生系統(tǒng)性誤差［11］和受雜質(zhì)干擾［12］等問(wèn)題.基于此，本文對(duì)qPCR技術(shù)在r AAV的GC測(cè)定中的最新應(yīng)用成果進(jìn)行綜述，并對(duì)qPCR在r AAV的GC測(cè)定中存在的問(wèn)題及解決策略進(jìn)行分析.

1 ITR-qPCR法的普適性

傳統(tǒng)qPCR法測(cè)定r AAV的GC時(shí)，其靶標(biāo)序列主要是轉(zhuǎn)基因序列或調(diào)控元件序列［13］.因此，每種r AAV載體均需要根據(jù)自身轉(zhuǎn)基因表達(dá)體系而設(shè)計(jì)引物或探針，qPCR的反應(yīng)條件也不盡一致，難以GC為質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行橫向比較.即使對(duì)于同一種r AAV載體，不同實(shí)驗(yàn)室所采用的靶標(biāo)序列及反應(yīng)條件也存在很大差異.如果能設(shè)計(jì)出一種不依賴于轉(zhuǎn)基因表達(dá)體系，對(duì)于各種r AAV可以普遍適用的GC定量方法，以及對(duì)于r AAV載體的質(zhì)量控制都顯得意義重大.

圖1 線型單鏈r AAV載體基因組結(jié)構(gòu)圖［10］Fig.1 Schematic drawing of linear and single-stranded r AAV vector genomes［10］

腺相關(guān)病毒（AAV）為單鏈線狀DNA病毒，其基因組僅編碼病毒復(fù)制與包裝所必需的Rep和Cap基因.AAV基因組兩端的反向末端重復(fù)序列（ITR）是包裝AAV所必需的最少的自身序列［14-16］.每個(gè)ITR含有145個(gè)核苷酸，前125個(gè)核苷酸會(huì)形成回文序列，折疊成“T”形二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1）.ITR在AAV復(fù)制起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，是AAV基因組自我復(fù)制的引物［16］，也是形成環(huán)狀A(yù)AV中間體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［17］.ITR是各種r AAV載體基因組所保留的AAV源序列，也是唯一的共同序列.因此，將ITR序列作為qPCR的檢測(cè)靶標(biāo)，正好能滿足普適性質(zhì)量控制指標(biāo)的設(shè)計(jì)理念.

Aurnhammer等［10］首次以r AAV中的ITR序列為靶標(biāo)，探索了通用性ITR-qPCR方法的可行性.AAV2 ITR序列（圖2）的5′端含有兩個(gè)臂回文結(jié)構(gòu)（B-B′和 C-C′）和一個(gè)莖回文結(jié)構(gòu)（A-A′），3′末端是單鏈形式的 D序列位.ITR-qPCR法所設(shè)計(jì)的引物和探針，其特異性靶向AAV 5′-ITR序列的一個(gè) DNA 序列（62nt）：反向引物（16nt）從 C′向 A′方向擴(kuò)增，正向引物（21nt）由D向 A′方向擴(kuò)增，探針（21nt）位于ITR正反引物間.通過(guò)定性PCR證明所設(shè)計(jì)的引物能夠擴(kuò)增出62 bp的PCR產(chǎn)物，且退火溫度在55～64.2℃之間，擴(kuò)增特異性良好.

ITR-qPCR法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：適用范圍廣，普遍適用于定量檢測(cè)絕大多數(shù)r AAV載體顆粒中的單鏈DNA（ssDNA）和載體質(zhì)粒的雙鏈DNA（dsDNA）；靈敏度高，檢測(cè)閾值約為50個(gè)質(zhì)粒拷貝數(shù)，即200個(gè)AAV ITR靶向位點(diǎn)；重復(fù)性好，批間及批內(nèi)誤差均低于目前被廣泛認(rèn)可的臨床試驗(yàn)閾值15%，能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室所制定的最嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［18-20］.蒙青林等［21］同樣用靶向ITR序列的qPCR法檢測(cè)r AAV2的GC，并與ELISA法測(cè)定的r AAV病毒滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)法測(cè)定的r AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度進(jìn)行比較，結(jié)果P／GC為59.6，GC／TU 為91.2，與 M.Lock等［22］報(bào)道的 AAV2標(biāo)準(zhǔn)品（AAV2 RSM）所測(cè)結(jié)果相近（P／GC＝28，GC／TU＝64.4）.ITR-qPCR法所具有的普適性，使其在r AAV滴度測(cè)定中具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值，且有助于推動(dòng)AAV滴度檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化.但該法也存在不足：r AAV廣泛存在的ITR發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)影響qPCR過(guò)程中的變性與退火等過(guò)程，特別是對(duì)自身互補(bǔ)型r AAV（scr AAV）影響更顯著.

圖2 r AAV2 ITR-qPCR法特異性引物和探針的設(shè)計(jì)［10］Fig.2 Design of r AAV2 ITR-qPCR primers and probe［10］

2 測(cè)定scr AAV基因組滴度時(shí)的系統(tǒng)誤差

scr AAV由于其轉(zhuǎn)染效率高于單鏈r AAV（ssr AAV），越來(lái)越受到科研工作者的親睞.在Hela細(xì)胞中，scr AAV的轉(zhuǎn)染效率是相應(yīng)ssr AAV的5～140倍，對(duì)于ssr AAV難轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，如B16F10，NIH3T3和3LL細(xì)胞，scr AAV都能有效轉(zhuǎn)染［23］.不同于ssr AAV的DNA單鏈結(jié)構(gòu)，scr AAV載體的末端之一為突變的ITRΔtrs［24］，在包裝時(shí)不能被切割而形成自身互補(bǔ)的DNA雙鏈結(jié)構(gòu) （圖3）.在變性過(guò)程，scr AAV基因組形成單鏈結(jié)構(gòu).但在退火過(guò)程中，由于scr AAV基因組中ITRΔtrs的存在，可以迅速形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，促進(jìn)與其相連的互補(bǔ)DNA鏈的退火（圖4a）.因此，引物與模板基因組結(jié)合的幾率則大大降低，導(dǎo)致所測(cè)GC低于DNA dot blotting等測(cè)得的GC值達(dá)10倍之高［11］.

圖3 自身互補(bǔ)型r AAV載體結(jié)構(gòu)及其引物位置設(shè)計(jì)示意圖［11］Fig.3 Diagram of the self-complementary r AAV vector genome with primer sites indicated［11］

Fagone等［11］研究了如何降低qPCR法的系統(tǒng)誤差，發(fā)現(xiàn)特異性引物的作用位置對(duì)qPCR法所測(cè)結(jié)果影響很大.目的擴(kuò)增產(chǎn)物距離ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)越遠(yuǎn)，系統(tǒng)誤差越小，如圖3中引物set3距ITRΔtrs1 204 bp，所引起系統(tǒng)誤差顯著小于set 1與set 2.因此，排除scr AAV的ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)與其相鄰擴(kuò)增子的干擾，是成功降低qPCR法系統(tǒng)誤差的關(guān)鍵.

圖4 scr AAV雙鏈病毒基因組酶切的qPCR流程示意圖Fig.4 Scheme of qPCR of scr AAV vector genome digested with endonuclease

Fagone等［11］對(duì)傳統(tǒng)qPCR法進(jìn)行了改良，用限制性核酸內(nèi)切酶去除ITRΔtrs發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到核酸內(nèi)切酶qPCR法（ED-qPCR）.ED-qPCR的變性過(guò)程使互補(bǔ)結(jié)合的雙鏈結(jié)構(gòu)解鏈成兩條單鏈，在退火時(shí)引物與模板基因組的結(jié)合排除了ITRΔtrs的影響，可以進(jìn)行正常的擴(kuò)增（圖4b），從而成功解決了qPCR法測(cè)定scr AAV的系統(tǒng)誤差問(wèn)題.

3 r AAV感染滴度的測(cè)定

GC并不能反映r AAV的功能，感染滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（TU）才是最好的功能指標(biāo).研究發(fā)現(xiàn)，r AAV的GC與病毒感染滴度的比值變動(dòng)范圍很寬，可達(dá)56～1 000［25-27］.所以GC的數(shù)值尚不能表征r AAV的功能，而r AAV感染滴度所反映的是r AAV感染細(xì)胞及其在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制效率，是評(píng)價(jià)其細(xì)胞內(nèi)功能的重要指標(biāo)，只有成功感染后才可能表達(dá)轉(zhuǎn)基因.因此，r AAV感染滴度的測(cè)定對(duì)于r AAV的臨床前及臨床研究很重要.

Clark等［28］首次利用qPCR法定量r AAV的GC和感染滴度，所得二者比值為60～120.Zhen等［29］改進(jìn)了以上方法，將野生型腺病毒與r AAV共同感染可表達(dá)AAV2 Rep／Cap基因的D7-4細(xì)胞系，以促進(jìn)r AAV基因組的復(fù)制；共感染48 h后，采用qPCR法測(cè)定r AAV基因組拷貝數(shù)，最后經(jīng)寇式方程計(jì)算感染滴度.因在每一個(gè)成功感染r AAV的細(xì)胞內(nèi)r AAV基因組均得以大量復(fù)制，大大提高qPCR測(cè)定靈敏度，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)病毒感染事件的檢測(cè).用該法測(cè)定6種含不同轉(zhuǎn)基因的AAV-2載體，GC與感染滴度比值為4～19，均低于先前文獻(xiàn)的報(bào)道.與之前的方法相比，該法更能準(zhǔn)確地反映r AAV感染滴度的真實(shí)性.

改良后的qPCR法不僅適用于已純化的r AAV樣品，對(duì)于未純化的r AAV樣品同樣適用.未純化的r AAV樣品經(jīng)高度稀釋可降低未知成分的干擾，采用DnaseⅠ可降解未包裝的DNA，NaOH可去除非特異性RNA，從而可成功消除影響qPCR法準(zhǔn)確測(cè)定的雜質(zhì)干擾［12］.該法適用于多種AAV-2載體感染滴度的測(cè)定，而對(duì)于不同表型的r AAV，只需對(duì)其靶細(xì)胞類型和感染條件進(jìn)行重新調(diào)整.但該法也存在不足，因?yàn)閞 AAV載體在濃縮的時(shí)候易發(fā)生不同程度的聚集，會(huì)干擾該法的測(cè)定；Zhen等［29］發(fā)現(xiàn)發(fā)生聚集的r AAV載體的GC與感染滴度比值高于未發(fā)生聚集的AAV載體達(dá)12.8倍，這可能是由于聚集的r AAV失去感染活性所致.

4 r AAV中rcAAV污染率的檢測(cè)

在r AAV載體的生產(chǎn)過(guò)程中，表達(dá)衣殼蛋白的輔助質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞DNA會(huì)被誤包裝或重組，成為可復(fù)制型AAV（rc AAV）或復(fù)制缺陷型AAV，其中rc AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后表達(dá)的衣殼蛋白被認(rèn)為是引起細(xì)胞免疫毒性的原因之一.采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的r AAV，rc AAV污染率可高達(dá)10%［30］，即使采用優(yōu)化工藝，rc AAV污染率也可達(dá)0.4%～1.0%.因此，r AAV中rc AAV污染率的測(cè)定非常必要.

由于r AAV制品中rc AAV的危害不小，但量相對(duì)較低，因此必須設(shè)計(jì)出高度靈敏的方法才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和定量分析.Mayfield等［31］設(shè)計(jì)出一種通過(guò)靶向3′末端的AAV-2 ITR D序列和5′末端的AAV-2 rep序列的高度靈敏的qPCR法，用于檢測(cè)和定量分析r AAV中rc AAV的污染率，該法可以定量的最低限度（LOQ）為1×109vg（載體基因組）r AAV制品中所含的0.256 fg線性質(zhì)粒DNA或拷貝數(shù)為56的rc AAV，從而成功解決r AAV中rc AAV污染率檢測(cè)的難題.

5 展望

r AAV基因藥物的臨床研究已充分證實(shí)其有效性和安全性，但其質(zhì)量控制體系的建立卻滯后于臨床應(yīng)用.r AAV基因藥物的準(zhǔn)確定量，是臨床用藥規(guī)范化的前提，也是不同工藝或不同廠家生產(chǎn)產(chǎn)品橫向比較的依據(jù)［32］.qPCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的產(chǎn)物處理過(guò)程，整個(gè)測(cè)定過(guò)程只需2～3 h，且靈敏度高，測(cè)定GC的最低檢測(cè)限為100 vg［28］；批間及批內(nèi)誤差均低于目前被廣泛認(rèn)可的臨床試驗(yàn)閾值15%［18-20］.

ITR-qPCR具有普適性，可定量檢測(cè)絕大多數(shù)r AAV載體，使r AAV滴度檢測(cè)更加標(biāo)準(zhǔn)化；ED-qPCR則成功解決了qPCR定量scr AAV滴度所引起的系統(tǒng)性誤差問(wèn)題，彌補(bǔ)了長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)qPCR檢測(cè)scr AAV滴度認(rèn)識(shí)的不足；檢測(cè)r AAV感染滴度的qPCR法靈敏度的提高，可測(cè)到比以往更高的病毒感染滴度，使應(yīng)用于臨床研究的r AAV功能指標(biāo)更加可靠；rc AAV污染率的qPCR法準(zhǔn)確測(cè)定，為合格的r AAV進(jìn)入臨床進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān).qPCR技術(shù)所具備的優(yōu)勢(shì)已充分展現(xiàn)了其未來(lái)廣闊的應(yīng)用前景，為此，負(fù)責(zé)制定高質(zhì)量r AAV參比標(biāo)準(zhǔn)的腺相關(guān)病毒參比標(biāo)準(zhǔn)事務(wù)委員會(huì)推薦qPCR作為定量r AAV滴度的方法［33］.隨著qPCR技術(shù)不斷改進(jìn)和發(fā)展，其作為r AAV質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的方法廣受推廣，極大促進(jìn)了r AAV基因藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)程.

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