響應(yīng)曲面法優(yōu)化海紅果水溶性多糖提取工藝及抗氧化活性的研究

賈琳斐，郭 姣，李清宇，范巧寧，張偉剛，彭 晶，段玉峰

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化海紅果水溶性多糖提取工藝及抗氧化活性的研究

賈琳斐，郭 姣，李清宇，范巧寧，張偉剛，彭 晶，段玉峰*

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化海紅果水溶性多糖（MPB）提取工藝的條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上依據(jù)回歸分析確定最佳工藝條件為：提取溫度86℃，提取時(shí)間4h，料液比1∶28g/mL，MPB的實(shí)際提取率可達(dá)8.33%。用MPB對(duì)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、DPPH自由基進(jìn)行清除能力和還原力的測(cè)定，研究MPB的抗氧化能力。結(jié)果表明，MPB對(duì)·OH、O2-·、DPPH均有一定的清除能力，對(duì)DPPH的清除作用尤為明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到87.12%，接近VC的94.47%，且MPB清除DPPH的IC50值為1.181mg/mL。

海紅果，多糖，響應(yīng)面分析，抗氧化活性

海紅果（Malus prunifolia（wild）Borkh）是薔薇科蘋果屬楸子的果實(shí)[1]，學(xué)名西府海棠，又名海紅子、海棠果、子母海棠、小果海棠[2]，主要分布于我國(guó)的晉、陜、蒙三省交界處[3]。海紅果營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)常食用可健胃消食、增強(qiáng)食欲[4]，軟化血管，成分分析研究表明，海紅果中含有人體必需的氨基酸、維生素及各種微量元素，素有“鈣王”之稱[5]，某些地區(qū)以海紅果代替山楂入藥，具有醒腦提神、去膩除腥的功效。

目前海紅果的研究主要集中在果制品、保健食品等領(lǐng)域，應(yīng)用在化妝品研發(fā)和藥物治療方面少之又少[6]。經(jīng)研究，植物多糖具有增強(qiáng)免疫[7]、降血糖、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老[8-9]的作用。海紅果中含有大量的多糖[10]，多糖的提取方法有水提法、酶提法、微波提取法、超聲波輔助提取法等[11]，本研究以海紅果為原料，應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化熱水浸提法提取海紅果中多糖的最佳工藝條件，以期為海紅果多糖的開發(fā)和綜合研究提供理論依據(jù)[12]。大部分多糖具有抗氧化作用[13]，目前對(duì)海紅果多糖抗氧化活性的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)海紅果多糖粗提物進(jìn)行了抗氧化活性研究，以期為進(jìn)一步研究海紅果多糖的性質(zhì)及功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海紅果 購(gòu)于山西保德縣；95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖 均為分析純；1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH）、抗壞血酸（VC）、鐵氰化鉀（[K3Fe（CN）6]）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚（焦性沒食子酸）、水楊酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 1-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海紅果多糖提取工藝 海紅果→粉碎→烘干（50℃）→取其粉末（加95%乙醇溶解）→水浴加熱（80℃，4h）→濾渣→烘干（50℃）→取粉末溶解（加蒸餾水）→水浴加熱→濾液→減壓濃縮至原溶液體積的1/3→醇沉（三倍體積95%乙醇，靜置12h）→取沉淀溶解（加蒸餾水）→脫蛋白（加入1/3體積氯仿∶正丁醇為3∶1）→攪拌→離心（30min，3000r/min）→上清液→透析48h→冷凍干燥→得海紅果粗多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱50g海紅果粉末分別置于500mL的圓底燒瓶中，按提取溫度為70℃，料液比為1∶20（g/mL），考察不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響，設(shè)計(jì)提取時(shí)間為2、3、4、5、6h，采用苯酚硫酸法測(cè)其多糖提取率。

1.2.2.2 溫度對(duì)多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱50g海紅果粉末分別置于500mL的圓底燒瓶中，按提取時(shí)間為4h，料液比為1∶20（g/mL），考察不同提取溫度對(duì)多糖得率的影響，設(shè)計(jì)提取溫度為50、60、70、80、90℃，采用苯酚硫酸法測(cè)其多糖提取率。

1.2.2.3 料液比對(duì)多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱50g海紅果粉末分別置于500mL的圓底燒瓶中，按提取時(shí)間為4h，提取溫度為80℃，考察不同提取溫度對(duì)多糖提取率的影響，設(shè)計(jì)料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL，采用苯酚硫酸法測(cè)其多糖提取率。

1.2.3 海紅果多糖提取工藝條件優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件中Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面分析實(shí)驗(yàn)。各因子編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of RAS test

1.2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分別置于干燥的試管中，各以水補(bǔ)至2.0mL，然后加入5%的苯酚溶液1.0mL及濃硫酸5mL，充分搖勻，室溫放置30min后在488nm處測(cè)定各溶液的吸光度，以2.0mL水按同樣步驟作為空白對(duì)照，再以葡萄糖濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度y（Abs）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程。

1.2.5 多糖提取率計(jì)算

1.2.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法[15]。

1.2.5.2 多糖提取率的測(cè)定 稱取海紅果粗多糖20.0mg，用蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻之后，吸取2mL按照1.2.4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方式操作后在488nm處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算多糖含量，根據(jù)公式計(jì)算多糖的提取率：

式中：W1：海紅果粉末的質(zhì)量（g）；W2：由W1提取的粗多糖的質(zhì)量（g）；W3：從W2中稱取的用于分析測(cè)定的粗多糖的質(zhì)量（g）；V：溶解W3定容后的體積（L）；C：由回歸方程計(jì)算所得的多糖的濃度（g/L）。

1.2.6 體外抗氧化活性的研究

1.2.6.1 MPB對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用 采用水楊酸法[16]，向試管中依次加入2mL 6mmol/L的FeSO4以及2mL不同濃度的多糖溶液，6mmol/L的H2O2溶液2mL，搖勻，靜置10min，再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL，搖勻，靜置30min后與510nm處測(cè)定吸光值，以VC作陽性對(duì)照，·OH的清除率按以下公式計(jì)算：

式中：A0—不加樣品溶液的吸光值；As—加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光值；Ax—不加水楊酸溶液時(shí)MPB的吸光值。

1.2.6.2 MPB對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法[17]。取pH為8.12的Tris-HCL緩沖液6mL，分別加入不同質(zhì)量濃度MPB溶液0.5mL，37℃水浴10min，最后加入預(yù)熱過的7mmol/L鄰苯三酚鹽溶液（PR）1mL，混勻后精確反應(yīng)4min，用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)325nm處吸光度值A(chǔ)，即為加入MPB溶液后鄰苯三酚的自氧化速率A樣品。以VC作陽性對(duì)照，O2-·的清除率按以下公式計(jì)算：

式中：A0—鄰苯三酚自氧化速率空白對(duì)照；A—加入樣品溶液反應(yīng)鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.6.3 MPB對(duì)DPPH·的清除作用 采用DPPH氧化法[18]，反應(yīng)的總體積為4mL，首先加入1mL不同濃度的MPB溶液，再加入3mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液（用95%乙醇配制）充分搖勻，室溫靜置35min，以95%乙醇調(diào)零，陰性對(duì)照不加樣，并以VC作為陽性對(duì)照，最后在517nm處測(cè)各自的吸光度。DPPH·的清除率按以下公式計(jì)算：

式中：A—樣品的吸光度；Ai—陰性對(duì)照。

1.2.6.4 還原能力的測(cè)定 MPB的還原力的測(cè)定按文獻(xiàn)[19]進(jìn)行，往配制好的不同濃度的MPB溶液中加入3mL，0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）和2.5mL 1%的鐵氰化鉀（[K3Fe（CN）6]）溶液，45℃水浴30min，加入2mL蒸餾水和1mL FeCl3（0.1%），以VC作為陽性對(duì)照，與700nm處測(cè)定吸光值，吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=0.1013x+0.0886，R2=0.9983。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 時(shí)間對(duì)海紅果多糖提取率的影響 如圖1所示，時(shí)間對(duì)海紅果多糖提取率的影響顯著，在2～4h內(nèi)海紅果多糖提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈逐漸上升趨勢(shì)；當(dāng)時(shí)間超過4h，隨時(shí)間的延長(zhǎng)提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)?，加熱時(shí)間過長(zhǎng)，多糖易發(fā)生水解，導(dǎo)致提取率下降。綜合考慮，選定提取時(shí)間為3～5h為最佳提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate

2.2.2 溫度對(duì)海紅果多糖提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)溫度在50～80℃之間時(shí)，海紅果多糖提取率隨提取溫度的升高而呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，多糖提取率隨溫度的升高而逐漸下降，這可能是由于溫度過高會(huì)影響多糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其降解，所以，選70～90℃作為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of temperatures on extraction rate

2.2.3 料液比對(duì)海紅果多糖提取率的影響 由圖3可看出當(dāng)料液比在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL時(shí)，多糖的提取率隨加水量的增加而呈上升趨勢(shì)，這是由于水量多有利于多糖的擴(kuò)散傳質(zhì)；當(dāng)料液比超過1∶25時(shí)，由于水量過多導(dǎo)致蒸發(fā)困難，而底物濃度過低，多糖的提取率呈逐漸下降趨勢(shì)，所以，選擇料液比為1∶20～1∶30g/mL為最佳料液比。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化海紅果多糖提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溫度、料液比三個(gè)因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，研究三因素不同組合對(duì)海紅果提取率的影響。實(shí)驗(yàn)因素和水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on extraction rate

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及海紅果多糖提取率的響應(yīng)曲面值Table 2 Box-Behnken design matrix and response values for the yield of MPB

通過中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到17組實(shí)驗(yàn)，其中1、2、8、10、13是中心實(shí)驗(yàn)，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，其余是析因?qū)嶒?yàn)。對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、料液比作如下?lián)Q算：A=（T-80）/10，B=（t-4）/1，C=（a-25）/5，以三次實(shí)驗(yàn)所得多糖的平均值為響應(yīng)值（D），得到回歸方程：D=8.00-0.29A-0.18B+0.33C+0.068AB+0.025AC+0.93BC-1.53A2-0.43B2-0.9C2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.9713，說明該模型可以解釋97.13%的響應(yīng)值變化，相關(guān)系數(shù)R=0.9975，說明響應(yīng)值（提取率）的變化有99.75%來源于所選變量，即提取溫度、提取時(shí)間和料液比，表明此模型擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小。模型變異系數(shù)CV值為4.26，CV值越小說明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好。由表4可知，各因素中一次項(xiàng)A、B、C是顯著的，交叉項(xiàng)BC是極顯著的，二次項(xiàng)A2、C2是極顯著的，B2是顯著的。

表3 模型方差分析Table 3 Variance for regression equation

2.3.2 響應(yīng)曲面分析 根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)海紅果得率的影響，響應(yīng)曲面如圖4～圖6所示，3組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖4 D=F（A，B）的響應(yīng)面Fig.4 Responsive surface plot D=F（A，B）

由圖4可知，當(dāng)料液比為最佳值（1∶28）時(shí)，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的交互作用。隨著溫度的上升、時(shí)間的延長(zhǎng)多糖提取率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。提取溫度和提取時(shí)間分別在70～90℃和3～5h的范圍內(nèi)，多糖提取率可以達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)的最大值。

圖5 D=F（A，C）的響應(yīng)面Fig.5 Responsive surface plot D=F（A，C）

由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間為最佳值（4h）時(shí)，提取溫度和料液比對(duì)多糖提取率的交互作用。隨溫度的上升，料液比的增大多糖提取率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。提取溫度在70～90℃范圍，液料比在1∶20～1∶30范圍時(shí)有較高的多糖提取率。

圖6 D=F（B，C）的響應(yīng)Fig.6 Responsive surface plot D=F（B，C）

由圖6可知，當(dāng)提取溫度為最佳值（86℃）時(shí)，提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖提取率的交互作用。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。提取時(shí)間在3～5h范圍，料液比在1∶20～1∶30范圍時(shí)有較高的多糖提取率。

由軟件可得海紅果多糖的最佳提取條件工藝為：提取溫度85.8℃，提取時(shí)間3.95h，料液比1∶28.08，此時(shí)提取率達(dá)8.36%。為實(shí)際操作方便，將工藝條件修正為：提取溫度86℃，提取時(shí)間為4h，料液比為1∶28g/mL，此時(shí)提取率為8.33%，實(shí)際測(cè)定值與理論預(yù)測(cè)值相差0.03%。

表4 提取回歸分析結(jié)果Table 4 Results of extraction regression analysis

2.4 MPB體外抗氧化活性結(jié)果與分析

2.4.1 MPB對(duì)·OH清除作用 MPB和VC對(duì)·OH的清除效果見圖7。由圖7可知，MPB和VC在0.2～1mg/mL范圍內(nèi)清除·OH有較好的量效關(guān)系，二者均隨濃度的增加清除率增強(qiáng)。MPB對(duì)·OH的清除率由27.69%增至48.41%，低于同質(zhì)量濃度下抗壞血酸的清除率。

圖7 MPB和VC對(duì)·OH清除效果Fig.7 Scavenging effect of MPB and VCon hydroxyl free

2.4.2 MPB對(duì)O2-·清除作用 MPB和VC對(duì)O2-·清除作用見圖8，由此圖可以看出，在0.2～1mg/mL的范圍內(nèi)，MPB和VC對(duì)O2-·自由基的清除具有量效關(guān)系。在小于0.4mg/mL的范圍內(nèi)，MPB對(duì)O2-·的清除作用不明顯；0.4～1mg/mL時(shí)，隨著MPB濃度的增加對(duì)O2-·的清除率逐漸增強(qiáng)，由1.98%增至14.66%。

圖8 MPB和VC對(duì)O2-·清除效果Fig.8 Scavenging effect of MPB and VCon superoxide anion free radicals

2.4.3 MPB對(duì)DPPH·清除作用 MPB和VC對(duì)DPPH·清除作用見圖9，由圖9可以看出，MPB對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用。隨著質(zhì)量濃度增大清除率逐漸增加，在0.2～1mg/mL的范圍內(nèi)，清除率由49.24%增至87.12%，在1mg/mL濃度時(shí)，接近VC的清除率94.47%。對(duì)MPB作回歸曲線，得到方程：Y=0.929x+ 0.3057（R2=0.909），計(jì)算得出MPB清除DPPH的IC50值為0.209mg/mL；同法，得到VC回歸曲線方程：Y=0.4948x+ 0.3711（R2=0.9852），計(jì)算得出，VC的IC50值為0.058mg/mL，小于DPPH的IC50值。

2.4.4 MPB還原能力測(cè)定 MPB和VC的還原力測(cè)定結(jié)果見圖10。由圖10可以看出隨著VC和MPB濃度增加，吸光度值逐漸增加，還原力逐漸增強(qiáng)；在0.2～1mg/mL范圍內(nèi)，MPB和VC還原力表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。同濃度VC的還原力略大于MPB。

圖9 MPB和VC對(duì)DPPH·清除效果Fig.9 Scavenging effect of MPB and VCon DPPH radical

圖10 MPB和VC的還原能力Fig.10 Reducing power of MPB and VC

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)，確定海紅果多糖的提取率的最佳工藝參數(shù)為：提取溫度86℃，提取時(shí)間4h，料液比1∶28g/mL，海紅果多糖的實(shí)際提取率可達(dá)8.33%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPB對(duì)、和自由基均有一定的清除活性，且MPB的還原能力較佳，其中MPB對(duì)DPPH·清除活性尤其明顯，IC50可達(dá)1.181mg/mL。

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表5 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The design and results of orthogonality experiment

3 結(jié)論

從徐州地區(qū)的24份天然發(fā)酵泡菜和50份天然發(fā)酵酸菜中初篩出174株產(chǎn)酸菌株；復(fù)篩后選出6株發(fā)酵乳pH低于3.6的菌株，進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株HLAB0143能在pH2.5的條件下生長(zhǎng)，具有良好的耐酸能力，紙層析顯示其發(fā)酵液主要為乳酸。采用形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16s rDNA測(cè)序分析，確認(rèn)該菌株為干酪乳桿菌。通過正交實(shí)驗(yàn)，確定了該菌株的最佳生長(zhǎng)條件，即溫度為37℃、接種量為1%（v/v）、初始pH控制為5。該菌株耐受低pH的主要機(jī)制為具有谷氨酸脫羧酶系活性，可轉(zhuǎn)化谷氨酸為γ-氨基丁酸。生長(zhǎng)特性和耐酸機(jī)制的定性研究為該菌株的后續(xù)研究和開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Study on optimization of water-soluble polysaccharides extraction from Malus prunifolia（wild）Borkh using response surface methodology and its antioxidant activities in vitro

JIA Lin-fei，GUO Jiao，LI Qing-yu，F(xiàn)AN Qiao-ning，ZHANG Wei-gang，PENG Jing，DUAN Yu-feng*
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710119，China）

Box-Behnken design was used to optimize the extraction conditions of water-soluble polysaccharides from Malus prunifolia（wild）Borkh.The experimental data were fitted to a second-order polynomial equation using multiple regression analysis and also examined using the appropriate statistical methods.The optimum extraction conditions were：optimized extraction time 4h，extraction temperature 86℃，and ratio of water to raw material 1∶28g/mL，the predicted yield of polysaccharides extracted was 8.33%.The antioxidant activity of the extraction was evaluated by scavenging hydroxyl radical（·OH），superox ide an ion free radical（O2-·），1-diphenyl-2-picrylhydrazy（DPPH·）and reducing power.The in vitro antioxidant results showed that the inhibition effects of MPB on·OH，O2-·，DPPH significant，MPB showed significant inhibitory effects on DPPH with IC50values of 1.181mg/mL，when the concentration of polysaccharides up to 1mg/mL，the scavenging capacity reached 87.12%，close to 94.47%by VC.

Malus prunifolia（wild）Borkh；polysaccharides；response surface methodology；antioxidation

TS201.2

B

1002-0306（2014）10-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.048

2013－08－28 *通訊聯(lián)系人

賈琳斐（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品功能成分開發(fā)及利用。

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2003B08，2006B16）。