T790M突變所致吉非替尼耐藥肺腺癌細胞放射敏感性變化及耐藥性逆轉的研究

張星南，鄒 文，馬進安，李學真

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，每年發(fā)病和死亡病例均為惡性腫瘤的首位。近十幾年來人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的廣泛應用給肺癌患者帶來很大的希望，但這種藥物在使用10～14個月就會出現(xiàn)耐藥。目前已知T790M突變是導致耐藥的主要機制。放療是腫瘤綜合治療的手段之一，近年來不少學者進行了放療聯(lián)合分子靶向藥物臨床試驗，顯示放療聯(lián)合分子靶向藥物的療效優(yōu)于單純放療。但分子靶向藥物耐藥后的非小細胞肺癌對放療是否敏感以及放療后對EGFR-TKIs的耐藥性是否有變化，目前尚無明確答案。故本研究對上述問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 吉非替尼敏感肺腺癌細胞株PC-9，大劑量吉非替尼沖擊結合逐步遞增濃度體外誘導獲得的T790M突變所致吉非替尼繼發(fā)性耐藥肺腺癌細胞株PC-9/GR，均由廣州呼吸疾病研究所贈予。

1.1.2 試劑和儀器 吉非替尼購自英國 AstreZeneca公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；兔抗人磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)抗體及鼠抗人β-actin抗體均購自Proteintech公司；Proteintech液相芯片試劑盒及Luminex閱讀儀由廣州益善生物有限公司提供；液相基因芯片系統(tǒng)由美國 Luminex公司提供。

1.2 方法

1.2.1 液相芯片法檢測PTEN mRNA的表達水平 將PC-9和PC-9/GR分別置于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞鋪滿瓶底達80%以上時即可進行傳代。取含有PC-9和PC-9/GR的細胞培養(yǎng)瓶各1個，加入裂解液，56 ℃下裂解反應2 h。采用美國NanoDrop公司超微量核酸蛋白分析儀檢測總mRNA純度。將樣本轉移至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55 ℃震蕩孵育過夜。次日將孵育板放在磁力架上1 min，洗滌液洗3次。加入擴增延伸探針和標記探針，50 ℃震蕩反應1 h，洗滌液洗2次。再加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50 ℃震蕩反應30 min，洗滌液洗2次。于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)為原始結果，顯示為微球中位熒光讀數(shù)，經(jīng)湖南省益善生物技術公司提供數(shù)據(jù)處理軟件產(chǎn)生最終結果。

1.2.2 免疫印跡法(Western blotting)檢測P-mTOR、P-Akt、PTEN蛋白表達水平 PC-9和PC-9/GR用放射免疫沉淀測試法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解，4 ℃，12 000 r/min(離心半徑10 cm)，離心5 min，將上清液分裝至離心管中，凍存于-20 ℃。按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)使用說明書操作，測定總蛋白濃度。分別將標準品和樣品按0、1、2、3、4、5、6 μl加到96孔板的標準品孔中和樣品孔中，添加稀釋標準品的溶液至20 μl，各孔加入200 μl BCA工作液，37 ℃放置30 min。測定562 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線計算出總蛋白濃度。

分別配10%～12%的分離膠和4%的濃縮膠，加入四甲基乙二胺(TEMED)后搖勻灌膠。根據(jù)每個樣品總蛋白上50～100 μg計算各個樣品所需取樣量上樣，開始電泳。濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。準備6張與膠同樣大小的濾紙和1張聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，按照3張濾紙、膜、膠、另3張濾紙的順序依次放好，接通電源，轉膜約2 h。轉膜完畢后，放入TBS-T(Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween)中洗1次×5 min。用麗春紅染膜，檢測蛋白轉膜的效率。5%脫脂奶粉封閉膜1 h，分別加入兔抗人p-mTOR、p-Akt、PTEN抗體，4 ℃過夜，0.2%TBS-T洗3次×15 min，加相應的二抗及3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)內參孵育45～60 min。0.2%TBS-T洗3次×15 min。使用增強化學發(fā)光(ECL)液(Thermo)與膜孵育3 min，在暗盒內與X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘，顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，進行灰度分析，獲取數(shù)據(jù)。

1.2.3 細胞照射及集落形成實驗觀察PC-9和PC-9/GR的放射敏感性 將細胞株PC-9和PC-9/GR制成單細胞懸液備用。取5個6孔板，照射劑量0、1、2 Gy時接種細胞數(shù)400個/孔，照射劑量4、6 Gy時接種細胞數(shù)800個/孔。將5個6孔板置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱中24 h，分別用0、1、2、4、6 Gy照射5個培養(yǎng)板。使用Varian醫(yī)用直線加速器6 MV X射線照射，射野面積為14 cm×10 cm，機架角180°，源皮距為97.5 cm，加2.5 cm等效補償物，劑量率3 Gy/min。照射后繼續(xù)培養(yǎng)13 d，吉姆薩染色，于倒置顯微鏡下計數(shù)含50個細胞以上的集落數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次。并計算集落形成率(PE)和細胞存活分數(shù)(SF)：PE=對照組集落數(shù)/接種細胞數(shù)，對照組指的是0 Gy照射組；SF=某一照射劑量實驗組的集落數(shù)/(該實驗組的細胞接種數(shù)×PE)×100%，實驗組指的是1、2、4、6 Gy劑量照射組。使用SPSS 19.0軟件擬合多靶單擊模型：SF=1-(1-e-D/D0)N。D=照射劑量，D0=平均致死量，N=外推數(shù)。D0為SF下降63%所需的劑量，D0越大，放射敏感性越低。N值代表細胞內靶的個數(shù)或所需擊中靶的次數(shù)，反映細胞對放射性損傷的修復能力，N增大表示細胞修復能力增強，殺死細胞所需劑量增大，放射敏感性降低。

1.2.4 細胞照射及MTT法檢測細胞的生長抑制情況 使用Varian醫(yī)用直線加速器6 MV X射線照射對數(shù)生長期的PC-9/GR，劑量2 Gy，劑量率3 Gy/min，照射后細胞繼續(xù)培養(yǎng)備用。接種時取對數(shù)生長期的PC-9/GR及照射后的PC-9/GR，制成單細胞懸液，濃度為(5～10)×104/ml。取96孔平底板，每孔加入細胞懸液100 μl，設空白對照組(只加入完全培養(yǎng)基)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，吸去原培養(yǎng)基，加入含不同濃度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L)吉非替尼的新鮮培養(yǎng)基100 μl，設對照組(細胞+不含藥培養(yǎng)基)，每個濃度設6個復孔。培養(yǎng)48 h后加入10 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl DMSO，振蕩30 s。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度(OD490 nm)。并計算：細胞抑制率=〔1-(OD加藥組-OD空白對照組)/(OD對照組-OD空白對照組)〕×100%?？瞻讓φ战M指只加入完全培養(yǎng)基組，對照組指加入細胞和不含藥培養(yǎng)基組，加藥組指加入細胞和含藥培養(yǎng)基組。應用改良寇氏法公式計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結果

2.1 PC-9和PC-9/GR PTEN mRNA表達水平比較 PC-9/GR中PTEN mRNA的相對含量為(0.077±0.000)，高于PC-9中的(0.047±0.000)，差異有統(tǒng)計學意義(F=133.651，P<0.05)。

2.2 PC-9和PC-9/GR p-mTOR、p-Akt、PTEN蛋白表達水平比較 PC-9/GR中p-mTOR、p-Akt、PTEN蛋白表達水平與PC-9比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

2.3 PC-9和PC-9/GR的放射敏感性 細胞集落經(jīng)吉姆薩染色結果見圖2。4個實驗組(1、2、4、6 Gy)中，PC-9的細胞SF都大于PC-9/GR，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同一細胞株不同劑量組兩兩比較：PC-9和PC-9/GR的每一實驗組的細胞SF都小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PC-9 1、2、4 Gy組細胞SF兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PC-9 4 Gy組細胞SP與PC-9 6 Gy組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；PC-9/GR 2、4、6 Gy組細胞SF與PC-9/GR 1 Gy組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PC-9/GR 2、4、6 Gy組細胞SF兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

劑量-存活曲線見圖3。使用SPSS 19.0軟件擬合多靶單擊模型：SF=1-(1-e-D/D0)N，求出D0和N。得出兩種細胞的多靶單擊模型，PC-9為：SF=1-(1-e-D/1.600)1.944，PC-9/GR為：SF=1-(1-e-D/1.021)1.495。分析結果顯示，PC-9/GR的放射敏感性較其親代PC-9升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4 細胞生長抑制率 不同濃度吉非替尼作用下，PC-9/GR和照射后PC-9/GR的IC50值分別為(31.78±2.11)和(11.09±1.92)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(F=158.22，P<0.05)。照射后不同濃度吉非替尼作用的PC-9/GR的生長抑制率均高于未照射的PC-9/GR，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4、圖4)。

Table1 Comparison of expression levels of associated proteins detected by Western blotting between PC-9 cells and PC-9/GR cells

細胞株p-mTORp-AktPTENPC-9049±005076±014012±003PC-9/GR015±004034±007065±025F值79212024012742P值<005<005<005

注：p-mTOR=磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B，PTEN=人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因

注：1為PC-9，2為PC-9/GR；p-mTOR=磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，p-Akt=磷酸化蛋白激酶B，PTEN=人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因

圖1 Western blotting法檢測p-mTOR、p-Akt、PTEN蛋白的表達情況

Figure1 The expressions of p-mTOR，p-Akt and PTEN proteins detected by Western blotting

圖2 吉姆薩染色后的細胞集落(20×20)

Figure2 The cell colonies with Giemsa staining

表2 不同照射劑量下細胞株PC-9和PC-9/GR的細胞SF比較

注：與PC-9 0 Gy組比較，*P值分別為0.013、0.000、0.000和0.000；與PC-9 1 Gy組比較，△P值分別為0.003、0.000和0.000；與PC-9 2 Gy組比較，▲P值分別為0.002和0.000；與PC-9 4 Gy組比較，☆P=0.406；與PC-9/GR 0 Gy組比較，★P值分別為0.007、0.000、0.000和0.000；與PC-9/GR 1 Gy組比較，▽P值分別為0.024、0.001和0.001；與PC-9/GR 2 Gy組比較，◇P值分別為0.093和0.053；與PC-9/GR 4 Gy組比較，◆P=0.742;-無數(shù)據(jù)

表4 不同濃度吉非替尼作用后的細胞生長抑制率比較

注：組1為PC-9/GR，組2為經(jīng)2 Gy 6 MV X線照射的PC-9/GR；-無數(shù)據(jù)

Table3 Comparison of the parameters of cell survival curves of two kinds of cells

細胞株D0值(Gy)N值Dq值(Gy)SF2PC-91600±00811944±01431064±00580481±0081PC-9/GR1021±00801495±01750410±00700203±0063F值781661179115527022018P值<005<005<005<005

注：D0=平均致死量，N=外推數(shù)，Dq=準閾劑量，SF2=2 Gy時存活分數(shù)

圖3 不同劑量6 MV X射線照射后兩種細胞株存活變化的速度

Figure3 The dose-survival curves of two kinds of cells with the action of different doses of 6 MV X ray

圖4 不同濃度吉非替尼作用下PC-9/GR和照射后的PC-9/GR細胞生長抑制變化的趨勢

Figure4 Growth inhibitory curves of unirradiated PC-9/GR cells and irradiated PC-9/GR cells with the action of different concentrations of gefitinib

3 討論

目前，人類對疾病的研究已深入到分子層面，其中細胞信號傳導系統(tǒng)是一個研究熱點。隨著研究進展，越來越多的信號通路被發(fā)現(xiàn)，最重要的是表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導通路。EGFR是一種廣泛表達于各種細胞的跨膜糖蛋白，主要與細胞外的生長因子和轉化生長因子α結合，被激活后啟動下游的信號傳導，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)主要有4條通路[1]：Ras-Raf-MAPK通路、PI3K-Akt通路、JAK/STAT通路和PLC-γ/PKC通路。PTEN蛋白具有阻止Akt磷酸化的作用，使其不能活化，從而阻斷PI3K-Akt信號傳導通路，而這條通路在腫瘤細胞抗凋亡和增殖中起著重要的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白表達水平過低可導致Akt的過度活化。Ginn-Pease等[4]發(fā)現(xiàn)在PTEN基因低表達的腫瘤細胞中導入PTEN基因，能夠提高腫瘤細胞的放射敏感性。

Akt在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細胞生存中發(fā)揮著重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路的激活與腫瘤細胞的放射耐受有關[6]。Akt磷酸化后被激活，可以繼續(xù)活化其他的眾多分子，從而使得信號通路傳導下去，最終達到促進細胞增殖、生長和抗凋亡的作用。p-Akt蛋白的高表達引起惡性腫瘤對放療不敏感。mTOR蛋白屬于PI3K-Akt的下游通路，p-Akt可直接磷酸化mTOR將其激活為有激酶活性的p-mTOR，該物質可繼續(xù)激活其他的分子，導致下游信號通路的傳導[7]，最終促進相關基因的轉錄和翻譯，促進細胞的增殖和分化。研究表明，mTOR異常激活與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，多種腫瘤均存在mTOR信號通路的過度激活[8]。p-mTOR的高表達導致惡性腫瘤的放射敏感性降低，放射治療的效果也降低[9]。

本研究集落形成實驗結果表明，在體外實驗中，細胞株PC-9/GR的放射敏感性較其親代細胞株PC-9升高。進一步研究顯示，PC-9的PTEN mRNA及其蛋白的表達水平低于PC-9/GR，而p-mTOR、p-Akt蛋白表達水平則高于PC-9/GR。由此推斷可能是T790M突變造成了PC-9/GR PI3K-Akt信號通路的改變，引起相關基因及其蛋白表達的變化，最終表現(xiàn)為放射敏感性的變化。具體的機制還需要進一步研究。何臣等[10]總結細胞株PC-9/GR的生物學特性為“擁有吉非替尼靶標的肺腺癌發(fā)生耐藥的機制，與選擇性獲得EGFR基因外顯子20 T790M突變細胞克隆有關，此克隆Akt、Erk1/2通路持續(xù)活化”，即該耐藥株EGFR下游信號通路是持續(xù)活化的。而本研究顯示PC-9的p-mTOR、p-Akt蛋白表達水平高于PC-9/GR。筆者認為可能的原因是T790M突變后的PC-9/GR的EGFR下游信號通路雖然是持續(xù)活化的，但其活化的程度較其親代PC-9弱，即PC-9/GR雖然獲得了吉非替尼耐藥的能力，但其增殖、抗凋亡的能力較其親代卻有所減弱，對射線的耐受能力亦減弱。具體的機制還需進一步研究。

集落形成實驗中，同一細胞株不同劑量組亦進行了兩兩比較，結果表明放射線對兩種細胞都有一定的殺傷作用，但PC-9的效應最大劑量是4 Gy，而PC-9/GR的效應最大劑量是2 Gy，再增加劑量也無法提高效果。這進一步說明PC-9/GR的放射敏感性較其親代PC-9升高。

人類EGFR基因包含28個外顯子，其中外顯子18-24編碼受體酪氨酸激酶功能區(qū)。迄今，在EGFR酪氨酸激酶區(qū)已檢測到了至少28種不同的突變，其中3種突變與腫瘤的耐藥機制有關，包括D761Y突變(外顯子19)、T790M突變和D770-N77linsNPG突變(外顯子20)。而T790M突變是導致酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼耐藥的主要機制。本研究對射線照射后的PC-9/GR能否逆轉吉非替尼的耐藥進行了探討，并設置對照，結果發(fā)現(xiàn)吉非替尼對照射后PC-9/GR的生長抑制率高于未照射PC-9/GR，照射后PC-9/GR的IC50值小于未照射PC-9/GR。由此說明在體外實驗的條件下，照射后的PC-9/GR對吉非替尼的敏感性較未照射的PC-9/GR升高，即射線照射后的PC-9/GR在一定程度上能逆轉吉非替尼的耐藥。筆者認為可能的原因有：射線作用于PC-9/GR的DNA，使EGFR基因突變或表達發(fā)生改變，EGFR不利于EGFR-TKIs結合的構型也發(fā)生變化，使得EGFR-TKIs重新易于結合于EGFR上，發(fā)揮抑制細胞生長增殖的作用，亦即射線使EGFR發(fā)生了第三次突變。具體原因仍需進一步研究。

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9 Nicholson KM，Anderson NG.The protein kinase B/Akt signaling pathway in human malignancy[J].Cell Signal，2002，14(5)：381-395.

10 何臣，徐軍.吉非替尼耐藥人肺腺癌PC-9/GR細胞株的建立及其生物學特性[J].中國病理生理雜志，2010，26(10)：2017.