川西北牦牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的分子流行病學(xué)調(diào)查

郝一妹, 張煥容,2, 張斌,2, 湯承

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2. 動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041)

川西北牦牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的分子流行病學(xué)調(diào)查

郝一妹1, 張煥容1,2, 張斌1,2, 湯承1

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2. 動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041)

為調(diào)查川西北地區(qū)牦牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的流行情況, 對采自川西北甘孜州和阿壩州的26份腹瀉牦牛糞便樣品進(jìn)行大腸桿菌分離, 分別以分離的大腸桿菌DNA和牦牛腹瀉糞便樣本提取的總DNA為模板, 采用PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)腸毒素大腸桿菌黏附因子K99+菌毛基因片段, 分析產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在牦牛腹瀉中存在情況, 同時(shí)比較兩種DNA提取方法對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌PCR檢出率的差異; 以分離自外表健康牦牛糞便的105株大腸桿菌DNA為模板, 采用PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)腸毒素大腸桿菌黏附因子K99+菌毛基因片段, 比較牦牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在外表健康牦牛和腹瀉牦牛中的攜帶情況. 結(jié)果：從26份牦牛腹瀉糞便樣本中共鑒定出84個(gè)大腸桿菌菌落攜帶K99菌毛基因, 這些菌落分別來自所有26份牦牛腹瀉樣品, 因此, 牦牛腹瀉樣本100%分離并檢測到攜帶K99+菌毛基因的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌; 而糞便總DNA檢測結(jié)果為K99+菌毛基因陽性率 84.62%(22/26), 糞便中提取的總DNA模板K99+菌毛基因PCR檢出率略低于分離鑒定的細(xì)菌DNA檢出率; 105株外表健康牦牛糞便樣本分離株中檢測到攜帶K99+菌毛基因的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌34株, 檢出率為32.38%(34/105), 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在牦牛腹瀉樣本中的檢出率顯著高于外表健康牦牛糞便的檢出率(P<0.001). 結(jié)果表明, 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在牦牛糞便中存在廣泛, 是引起牦牛腹瀉的一種重要病原菌; 以糞便中提取的總DNA為模板, 可快速檢測牦牛糞便中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的存在.

牦牛; 腹瀉; 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌; K99+菌毛基因

致病性大腸桿菌包括產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌( Shiga toxin-producing Escherichia coli , STEC), 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC), 腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC), 腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC)和彌散粘附型(diffusely adherent Escherichia coli, DAEC)[1]. ETEC是致人、畜腹瀉最常見的大腸桿菌, 具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[2]. 國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為ETEC能產(chǎn)生兩種致病因子, 即黏附因子和腸毒素[3-4]. ETEC主要借助其所產(chǎn)生的菌毛抗原黏附于小腸粘膜, 定居并產(chǎn)生腸毒素而呈現(xiàn)致病作用[5]. 雖然大腸桿菌血清型很復(fù)雜, 但牛的ETEC一般都含有K99﹑F41﹑31A﹑FY(ATT25)等菌毛抗原, 其中以 K99﹑F41最為常見[6], 只要檢測到攜帶K99菌毛基因的大腸桿菌, 即可判定該大腸桿菌為ETEC[7-8]. 世界多個(gè)國家對牛的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行了深入的調(diào)查研究. 而牦牛作為青藏高原特色的物種之一, 對其含K99+菌毛基因產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的攜帶情況未見文獻(xiàn)報(bào)道. 本研究對川西北地區(qū)阿壩州和甘孜州腹瀉牦牛的糞便總DNA和從腹瀉糞便樣品中分離的大腸桿菌提取的DNA, 以及外表健康牦牛糞便分離的大腸桿菌DNA進(jìn)行ETEC黏附因子K99+菌毛基因PCR檢測, 以弄清牦牛源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的流行情況, 為該病的防治提供理論, 并為該種致病菌的臨床快速檢測提供可靠的方法.

1 材料與方法

1.1 菌株和糞便樣本

外表健康牦牛源大腸桿菌105株, 分離自川西北甘孜州和阿壩州來源的待屠宰牦牛糞便棉拭子, 由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存[9]; 大腸桿菌 C83912, 購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心; 16份來自甘孜州塔公草原和10份來自阿壩州若爾蓋腹瀉牦牛的新鮮糞便樣本.

1.2 引物合成

參照文獻(xiàn)[10]中引物序列合成產(chǎn)腸毒素大腸桿菌黏附因子K99+菌毛基因引物1對. 引物信息見表1, 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成.

表1 引物信息Table 1 Information for primers

1.3 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker 600均購自大連寶生物公司; 瓊脂糖購自大連寶生物工程; 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司.

1.4 糞便樣品的預(yù)處理[11]

每份糞便樣本0.5g加入裝有750μL無菌PBS緩沖液(0.05mol/L, pH7.4)的1.5 mL離心管中充分振蕩搖勻5-10min后500rpm 離心5min, 取上清液. 此步驟重復(fù)3次. 上清液5 000rpm/min離心10min, 收集沉淀臵于1.5 mL離心管中. 沉淀物重懸于1mL雙蒸水中.

1.5 糞便總DNA的提取

取上述糞便樣品預(yù)處理液, 根據(jù)盧圣棟[12]改良的酚/氯仿抽提法提取總DNA 作為模板.

1.6 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及DNA提取

將糞便棉拭子接種于含LB培養(yǎng)液中, 預(yù)增菌8 h, 接種環(huán)沾取一環(huán)用三分區(qū)逐步稀釋劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基, 臵37℃培養(yǎng)24 h, 觀察其菌落特征. 挑取特征菌落增菌后按酚-氯仿法提取細(xì)菌DNA.

1.7 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K99+菌毛基因PCR檢測方法的建立

采用下述反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5μL, dNTP10 mmol/L2μL, 上下游引物均為10 pmol/L各1μL, Taq酶5U/L 0.2μL, DNA模板2μL, 加超純水至總體積25μL ; PCR反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性5min, 94℃變性30s, 55℃退火40s, 72℃延伸50s, 共30個(gè)循環(huán), 72℃延伸10min; 以參考菌株作為陽性對照, 滅菌超純水作為空白對照,建立產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K99+菌毛基因的PCR檢測方法.

1.8 細(xì)菌DNA和糞便樣品總DNA的PCR檢測

采用1.7中建立的方法對105株分離自外表健康牦牛糞便的大腸桿菌DNA以及26份糞便樣品中分離的93株大腸桿菌DNA和26份腹瀉糞便總DNA進(jìn)行PCR檢測.

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K99+菌毛基因PCR檢測方法

以參考菌株作為陽性對照, 滅菌超純水作為空白對照, 成功建立產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K99+菌毛基因的PCR檢測方法, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析, 獲得了約200bp的特異性條帶, 經(jīng)測序證實(shí)目的片段大小為230bp.

2.2 腹瀉糞便樣品中分離細(xì)菌的K99+菌毛基因PCR檢測結(jié)果

從26份腹瀉糞便樣品中共挑取93個(gè)可疑菌落, 菌落增菌后提取DNA經(jīng)PCR檢測, 其中84個(gè)菌落來源的DNA檢測出K99+菌毛基因片段, 而這84個(gè)菌落分屬于26份腹瀉糞便樣品, 隨機(jī)抽取PCR產(chǎn)物測序證實(shí)為

230bp的目的基因. 因此, 經(jīng)細(xì)菌分離后, 腹瀉樣品中100%檢測到K99+菌毛基因.

2.3 腹瀉糞便樣品總DNA K99+菌毛基因PCR檢測結(jié)果

26份腹瀉樣品總DNA中, 有22份獲得了與預(yù)期目的片段大小相符的特異性條帶, 隨機(jī)抽取PCR產(chǎn)物測序證實(shí)為230bp的目的基因片段, 26份腹瀉樣品總DNA中K99+菌毛基因陽性檢出率為84.62%(22/26).

2.4 外表健康牦牛源大腸桿菌DNA K99+菌毛基因PCR檢測結(jié)果

105株外表健康牦牛源大腸桿菌DNA經(jīng)PCR檢測, 其中34株的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了特異性條帶, 陽性檢出率為32.38%(34/105), 隨機(jī)抽取PCR產(chǎn)物測序證實(shí)為230bp的目的基因片段. 部分樣品的 PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖1.

圖1 腹瀉牦牛糞便樣本部分菌株K99基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DNA MarkerII，N：陰性對照，P：陽性對照，1～12: 不同菌株K99基因PCR擴(kuò)增擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

牦牛是分布在海拔3000米以上的古老牛種之一. 中國有1400多萬頭, 是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種最多的國家, 約占世界牦?？倲?shù)的95%以上[13]. 牦牛對高寒草地生態(tài)環(huán)境條件具有很強(qiáng)的適應(yīng)性, 能在空氣稀薄、牧草生長期短、氣候寒冷的惡劣環(huán)境條件下生活自如, 繁衍后代, 并為牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生產(chǎn)、生活必需品, 是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟(jì)中不可缺少的畜種. 牦牛腹瀉癥是目前危害牛業(yè)生產(chǎn)的主要疾病之一. 臨床上以排水樣、糊狀或褐色糞便為特征[14], 給牦牛業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失. 本試驗(yàn)對外表健康牦牛糞便中分離的105株大腸桿菌經(jīng)K99+菌毛基因PCR擴(kuò)增鑒定, 發(fā)現(xiàn)其中34株攜帶K99+菌毛基因, 陽性率高達(dá)32.38%(34/105),而腹瀉樣本經(jīng)直接提取糞便總DNA和經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)后PCR 檢測, K99+菌毛基因檢出率分別為84.62%(22/26)和100%(26/26). 可見從外表健康牦牛糞便中分離的大腸桿菌K99+菌毛基因攜帶率明顯低于臨床腹瀉牦牛糞便樣品總DNA 和經(jīng)分離鑒定的大腸桿菌中提取的DNA檢出率. 推測攜帶K99+菌毛基因的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是引發(fā)川西北牦牛腹瀉的重要原因之一. 本試驗(yàn)針對牦牛腹瀉樣本, 分別采取了糞便總DNA和分離細(xì)菌的DNA作為PCR檢測模板, 糞便總DNA檢出率略低于分離細(xì)菌的DNA檢出率, 但兩種DNA PCR檢測結(jié)果差異不顯著, 直接提取糞便總DNA作為PCR檢測模板大大縮短了檢測時(shí)間, 人力和材料消耗少, 能夠達(dá)到快速檢測的目的; 而先分離細(xì)菌再檢測, 耗時(shí)長, 工作量大, 但檢測結(jié)果更準(zhǔn)確.

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Investigation of enterotoxigenic escherichia coli isolated from yak in northwest Sichuan Province

HAO Yi-mei, ZHANG Huan-rong, ZHANG Bin, TANG Cheng
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.;
2. Key Laboratory of Sichuan Institutes of Higher Learning, Chengdu 610041, P.R.C.)

In order to investigate the enterotoxigenicEscherichia coli(ETEC) in yaks distributed in northwest Sichuan province,Escherichia coli(E. Coli.) is isolated from diarrhea or healthy-looking yak fecal samples collected from Ganzi and Aba prefectures in Northwest Sichuan province, and then total DNA extracted from diarrhea fecal samples or isolatedE. Coli.DNA is used as template in PCR to amplify ETEC K99+gene. ETEC K99+gene positive rate is 84.62% (22/26) in the 26 yak diarrhea fecal sample total DNA, and 84E.Coli.colonies isolated from 26 yak diarrhea fecal samples are identified as ETEC carrying K99+gene distributing in all 26 yak diarrhea fecal samples; 34 strains of ETEC containing K99+gene are identified in 105E.Colistrains isolated from healthy-looking yak fecal samples, theE. Coli.K99+gene positive rate is 32.38% (34/105). The results show that ETEC exists in both yak diarrhea feces and healthy-looking yak feces, which is a major pathogen in yak diarrhea disease; total DNA extracted from diarrhea fecal samples can be used to rapidly identify ETEC in yak feces.

S852.61, S858.23

A

1003-4271(2014)01-0016-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.03

2013-08-17

湯承(1963-), 男, 教授, 博士, E-mail:Tangcheng101@163.com.

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新課題(CX2013SZ67); 國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD13B06).