椰纖果發(fā)酵液中降解細(xì)菌纖維素酵母菌株的分離及鑒定

李斌，鐘春燕，王錫彬，王志國，向東*（.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口5708；.海南椰國食品有限公司，海南?？?703）

椰纖果發(fā)酵液中降解細(xì)菌纖維素酵母菌株的分離及鑒定

李斌1，鐘春燕2，王錫彬1，王志國1，向東1*
（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南椰國食品有限公司，海南?？?70311）

從被微生物污染的椰纖果發(fā)酵液中分離篩選出13株能夠降解細(xì)菌纖維素的酵母菌株，并對(duì)這些菌株產(chǎn)生的纖維素酶粗酶液進(jìn)行了酶活測(cè)定。選擇羧甲基纖維素酶活（CMCA）和濾紙酶活（FPA）較高的酵母菌株3-1進(jìn)行了鑒定，鑒定酵母菌株3-1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），菌株培養(yǎng)液CMCA為71.48 IU，F(xiàn)PA為81.07 IU。

東方伊薩酵母；纖維素酶；分離；細(xì)菌纖維素

以椰子水作為生產(chǎn)培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)品“椰纖果”（俗稱“椰果”或“高纖椰果”），其主要成分是細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC），纖維素通常占干質(zhì)量的95%以上。由于采用淺盤靜置發(fā)酵，最終發(fā)酵得到的細(xì)菌纖維素成品通常呈膜狀，具有一定厚度，呈白色凝膠狀。細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)與植物纖維素的結(jié)構(gòu)一致，同屬于天然纖維素，其分子結(jié)構(gòu)上與天然（植物）纖維素相同，均是D-葡萄糖之間以β-1，4糖苷鍵聚合而成[1-2]，細(xì)菌纖維素與植物纖維素的主要區(qū)別在于：無木質(zhì)素、果膠和半纖維素等伴生產(chǎn)物，具有高結(jié)晶度（可達(dá)95%，植物纖維素的為65%）以及高的聚合度（degree of polymerization，DP）值（2 000～8 000）。從分子結(jié)構(gòu)和纖維素酶催化水解纖維素的機(jī)理來看，能夠降解植物纖維素的纖維素酶也能夠降解細(xì)菌纖維素，但目前這方面的研究較少報(bào)道。

從自然界中篩選產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株，較為常見的是霉菌，這些菌株已被應(yīng)用生產(chǎn)或可為生產(chǎn)高活性纖維素酶提供新菌種或酶基因[3]，不同霉菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件及酶學(xué)性質(zhì)也有較多報(bào)道[4-7]。除霉菌外，利用細(xì)菌發(fā)酵也可生產(chǎn)纖維素酶，細(xì)菌分泌的纖維素酶大部分都適應(yīng)中性和偏堿性的環(huán)境，對(duì)天然纖維素具有很強(qiáng)的分解能力，相關(guān)研究報(bào)道較多[8-11]。在菌株選育方面，文獻(xiàn)報(bào)道了利用紫外線和亞硝酸復(fù)合誘變進(jìn)行高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定[12]。近年來利用基因重組技術(shù)獲得產(chǎn)纖維素酶的工程菌株成為研究熱點(diǎn)[13]，有文獻(xiàn)報(bào)道將具有纖維素酶基因的重組工程菌株定植于動(dòng)物消化道內(nèi)，從而提高飼料粗纖維消化率[14-15]。酵母菌通常被認(rèn)為不產(chǎn)或極少產(chǎn)纖維素酶，相關(guān)報(bào)道較少，有研究者報(bào)道了從海洋微生物中篩選到一株產(chǎn)纖維素酶的酵母菌，具有較高的酶活力[16]。本研究從被污染的椰纖果發(fā)酵液中篩選分離出能夠降解細(xì)菌纖維素凝膠的酵母菌株，并對(duì)其中纖維素酶活力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化學(xué)試劑均為分析純：上海國藥集團(tuán)；生化試劑：上海生工公司。

1.1.1 菌株

細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)菌株：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）HN001，海南大學(xué)食品綜合實(shí)驗(yàn)室保藏。

細(xì)菌纖維素降解菌株：海南某椰纖果生產(chǎn)車間中發(fā)生污染的椰纖果發(fā)酵液中采樣。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)培養(yǎng)基：椰子水50 mL，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.2g，蔗糖3g，蒸餾水50mL，pH值自然。

菌株篩選固體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）0.6 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O0.2g，瓊脂2.0g，蒸餾水100mL，pH值自然。

菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 1.0 g，蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHP-1500生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；WFJ7200型分光光度計(jì)：上海尤尼柯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。1.3菌株的篩選與分離

1.3.1 采樣

采樣地點(diǎn)為海南某椰纖果生產(chǎn)車間，椰纖果生產(chǎn)方式為淺盤靜置發(fā)酵。挑選被微生物污染而發(fā)生明顯纖維素降解的發(fā)酵盤，用滅菌的移液管吸取椰纖果污染部位5 mL發(fā)酵液，裝入滅菌的空試管中備用。

1.3.2 細(xì)菌纖維素凝膠的培養(yǎng)

將菌株A.xylinumHN001接種于細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2～3 d，直至液體培養(yǎng)基上層出現(xiàn)一層3～5 mm厚度的細(xì)菌纖維素凝膠薄膜。

1.3.3 降解細(xì)菌纖維素菌株的篩選與分離

將1.3.1采樣獲得的發(fā)酵液做系列稀釋梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分別涂布篩選平板，平板采用1.1.2中所述的菌株篩選固體培養(yǎng)基。倒置恒溫28℃培養(yǎng)2 d，分離出能夠旺盛生長的菌株，將菌株編號(hào)，用接種環(huán)挑取少許菌體涂布于1.3.2中所獲得的細(xì)菌纖維素凝膠薄膜表面，培養(yǎng)觀察2～3 d，若發(fā)現(xiàn)細(xì)菌纖維素凝膠膜出現(xiàn)明顯的降解，則證明該菌株能夠產(chǎn)生纖維素酶，并具有降解細(xì)菌纖維素的能力。

1.4 酶活的測(cè)定

篩選出的菌株用1.1.2所述的菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，粗酶液采用國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（internationalunion of pure and applied chemistry，IUPAC）推薦的方法[17]來測(cè)定濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）和羧甲基纖維素酶活（carboxyl methyl cellulose enzyme activity，CMCase）。酶活力單位用國際單位IU來表示，纖維素酶酶活力單位的定義：在酶的催化下，每分鐘形成1 μmol葡萄糖時(shí)所用該酶的量為1個(gè)酶活國際單位（IU）。

1.5 菌株的鑒定

篩選出纖維素酶活力較高的菌株，委托中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的采樣

從海南某椰纖果廠生產(chǎn)車間中挑選出被微生物污染的細(xì)菌纖維素凝膠，圖1為凝膠表面部分纖維素被降解，表面出現(xiàn)空洞狀，圖2凝膠完全被降解，呈液體狀。圖1和圖2表明在污染椰纖果細(xì)菌纖維素凝膠的微生物中，存在能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物，導(dǎo)致細(xì)菌纖維素發(fā)生降解。按照1.3.1所述的方式進(jìn)行采樣，可以篩選出產(chǎn)纖維素酶的微生物菌株。

圖1 部分被降解的細(xì)菌纖維素Fig.1 Partly degraded bacterial cellulose

圖2 全部被降解的細(xì)菌纖維素Fig.2 Completely degraded bacterial cellulose

2.2 篩選和分離

按照1.3.3所述的方法對(duì)菌株進(jìn)行篩選和分離，共篩選分離出13株能夠產(chǎn)纖維素酶的菌株，分別編號(hào)為1-1；1-2；1-3；2-1；3-1；3-2；3-3；4-1；4-2；4-3；5-1；5-2；5-3，通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)這些菌株均為酵母菌。這些菌株的菌體涂布于1.3.2所述的細(xì)菌纖維素凝膠膜表面，均能對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行降解。

2.3 酶活測(cè)定

2.3.1 羧甲基纖維素酶活力測(cè)定

對(duì)篩選出的13株酵母按1.1.2中的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)，離心分離后測(cè)定其上清液CMC酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各株酵母培養(yǎng)液均有一定CMC酶活，但差異較大，由圖3可知，1-2酵母菌株培養(yǎng)液CMC酶活性較高。

圖3 菌株發(fā)酵液CMC酶活Fig.3 CMCA of strain fermentation broth

2.3.2 濾紙酶活力的測(cè)定結(jié)果

對(duì)篩選出13株酵母按1.4中的方法進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)后，離心分離后測(cè)定其上清夜FPA酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各株酵母培養(yǎng)液均有一定FPA酶活，如圖4所示。由圖4可知，3-1，1-3酵母菌株培養(yǎng)液FPA酶活性較高。

圖4 菌株發(fā)酵液濾紙酶活Fig.4 FPA of strain fermentation broth

從上述13株酵母菌選擇CMC酶活及FPA酶活都相對(duì)較高的菌株3-1，委托中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行鑒定。

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 培養(yǎng)和顯微形態(tài)特征

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3 d，細(xì)胞球形、臘腸形，大小為（3.6～10.8）μm×（2.4～6.0）μm，有沉淀形成。麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)30 d，菌落奶酪狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣須狀。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，產(chǎn)生假菌絲。菌株3-1顯微形態(tài)如圖5所示。

圖5 酵母菌株3-1顯微形態(tài)Fig.5 Morphology of yeast strain 3-1

2.4.2 理化特征

由表1可知，菌株3-1可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、棉子糖等其他糖類，碳源只能同化琥珀酸及檸檬酸，不能同化其他碳源，這表明本菌株可利用的碳源范圍較窄，在培養(yǎng)環(huán)境中出現(xiàn)碳源缺乏時(shí)，可產(chǎn)生纖維素酶對(duì)纖維素進(jìn)行降解，使之產(chǎn)生能夠利用的葡萄糖單元。

2.4.3 rRNA基因ITS區(qū)序列測(cè)定

通過rRNA基因ITS區(qū)序列，結(jié)果如下：

GTCTCGCAACACTCGCTCTCGGCCGCCAAGCGT CCCTGAAAAAAGTCTAGTTCGCTCGGCCAGCTTCGC TCCCTTTCAGGCGAGTCGCAGCTCCGACGCTCCTTT ACACGTCCGCTCCCCCAACTCTGCGCACGCGCAAGA TGGAAACGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCCGGAA TGCCGAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAGAACTCGAT GATTCACGATGGCTGCAATTCACACTAGGTATCGCA TTTCGCTGCGCTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAG ATCCGTTGTTGAAAGTTTTGTTTGTTTTTCGTAGATT TCTCTTGTCGACTATATTCCACATTTTAGGTGTTGTT GTTTTCGTTCCGCTCACGCAGTCTAGTACTAAATCA CAGTAAGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACC TTGTTACGAC。

根據(jù)上述鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株3-1為一株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。

3 結(jié)論

海南自1997年開始，利用豐富的椰子水資源作為培養(yǎng)基，以木醋桿菌為菌種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素凝膠（又稱椰纖果），采用淺盤方式培養(yǎng)，生產(chǎn)周期為4～7 d。目前年生產(chǎn)能力近30萬t，產(chǎn)值超過10億元，是近年來海南新興的食品工業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，纖維素凝膠的主要成分為纖維素，凝膠干質(zhì)量中99%都為纖維素。而由于生產(chǎn)技術(shù)不成熟，雜菌污染嚴(yán)重，損失約占總產(chǎn)量的40%～50%。經(jīng)調(diào)查研究表明，造成細(xì)菌纖維素凝膠生產(chǎn)損失的微生物有酵母、霉菌和細(xì)菌。而其中能造成毀滅性破壞的只有酵母菌，約占總損失量的90%。一盤300 g的椰纖果細(xì)菌纖維素凝膠48 h就可以被酵母菌降解為液體，這與相關(guān)報(bào)道酵母菌很少產(chǎn)酶或不產(chǎn)酶十分矛盾。

本研究篩選的一株東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在產(chǎn)酶培養(yǎng)液中培養(yǎng)5d，測(cè)定的CMC酶活達(dá)71.48IU，F(xiàn)PA濾紙酶活達(dá)81.07IU，離心后的清液干質(zhì)量為4%，如按干質(zhì)量計(jì)算CMC酶活達(dá)2026.75IU，F(xiàn)PA酶活達(dá)1167.5IU。而產(chǎn)酶較高的木霉的CMC酶活在1 200～1 800 IU，F(xiàn)PA濾紙酶活在300～600 IU左右。由此可知，酵母產(chǎn)酶活性可與目前產(chǎn)酶量最高的木霉相媲美，與目前市售纖維素酶試劑相當(dāng)。本研究證明一些酵母菌在特定條件下，能大量地產(chǎn)生纖維素酶，而且具有較高的酶活力。酵母菌安全性高，而且具有酶的外分泌性和產(chǎn)酶量高的特點(diǎn)，高產(chǎn)纖維素酶酵母的發(fā)現(xiàn)，必將對(duì)纖維素酶的研究與利用產(chǎn)生重大的影響。

[1]孫召霞，張素風(fēng)，梅星賢.細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].湖北造紙，2013（3）：12-14.

[2]李靜.細(xì)菌纖維素的制備及結(jié)構(gòu)與性能研究[D].青島：青島大學(xué)碩士論文，2008.

[3]閆峰，徐鳳花，顧金剛，等.木霉屬真菌的生物降解及生物轉(zhuǎn)化作用研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2009，29（3）：77-80.

[4]劉森林，邢苗，劉剛，等.堿性纖維素酶革蘭氏陰性菌株篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物通報(bào)，2005，32（4）：91-94.

[5]林志偉，孫冬梅，張紅梅，等.黃綠木霉菌產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化[J].微生物通報(bào)，2008，35（1）：59-62.

[6]伍紅，陸兆新，呂玫，等.黑曲霉AF-98固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)酶條件研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2006，25（3）：475-480.

[7]胡翠英，李良智，趙建，等.三種霉菌產(chǎn)纖維素酶能力分析與培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014（1）：182-187.

[8]桂春燕.耐鹽堿產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的選育及酶學(xué)特性的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2010.

[9]韓學(xué)易.枯草芽孢桿菌纖維素酶產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2006.

[10]吳敏峰.產(chǎn)纖維素酶兼性厭氧芽孢桿菌的分離篩選及在動(dòng)物生產(chǎn)上的初步應(yīng)用[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

[11]程仕偉，李坦坦，梁會(huì)會(huì)，等.響應(yīng)面優(yōu)化金橙黃微桿菌YT9的發(fā)酵條件生產(chǎn)纖維素酶[J].中國釀造，2013，32（4）：48-51.

[12]武秀琴.纖維素酶高產(chǎn)菌株的誘變選育[J].中國釀造，2009，28（3）：84-86.

[13]趙瑩.酸性纖維素酶基因在大腸桿菌和乳酸桿菌的表達(dá)及其活性檢測(cè)[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2008.

[14]孫琳.無抗性標(biāo)記表達(dá)纖維素酶的羅伊乳桿菌重組菌的構(gòu)建[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2011.

[15]李旺.纖維素酶基因重組野生型乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2010.

[16]張亮.產(chǎn)纖維素酶海洋普魯蘭類酵母的初步研究及CMCase的純化與性質(zhì)研究[D].青島：中國海洋大學(xué)碩士論文，2008.

[17]GHOSE T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure Appl Chem, 1987,59(2):257-268.

Isolation and identification of yeast strains fromnata decoco fermentation broth for degrading bacterial cellulose

LI Bin1,ZHONG Chunyan2,WANG Xibin1,WANG Zhiguo1,XIANG Dong1*
(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.Hainan Yeguo Foods Co.,Ltd.,Haikou 570311,China)

From fermentation broth of polluted natade coco,13 yeast strains for degrading bacterial cellulose were isolated and the filter paper activity (FPA)and carboxyl methyl cellulose enzyme activity(CMCA)in crude fermentation broth were measured.The yeast strain 3-1 was chosen based on its higher FPA and CMCA,and it was identified asIssatchenkia orientalis.The CMCA and FPA of the strain 3-1 fermentation broth were 71.48 IU and 81.07 IU,respectively.

Issatchenkia orientalis;cellulase;isolation;bacterial cellulose

Q93-335

A

0254-5071（2014）07-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.011

2014-04-01

海南省自然科學(xué)基金（312076）

李斌（1966-），男，實(shí)驗(yàn)師，?？?，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程及食品分析。

*通訊作者：向東（1976-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)及食品發(fā)酵工程。