鹽度脅迫下口蝦蛄Mn-SOD 基因的表達分析

劉海映，張紅，陳雷，邢坤，于曉明，田燚

(1.大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連116023;2.大連海洋大學 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連116023)

超氧化物歧化酶(SOD)是McCord等［1］從牛紅細胞中發(fā)現(xiàn)并正式命名的，是各種生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類。根據(jù)與其結(jié)合的金屬離子不同，SOD可分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-SOD。SOD 能消除體內(nèi)的氧自由基，可對抗和阻斷氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞［2］。水生生物在逆境脅迫(如重金屬、污染、強光、離子輻射、極端溫度、水分脅迫、鹽度脅迫等)下，生物體內(nèi)的SOD 酶在防御外來壓力、消除過量的O-2·、維持生物體內(nèi)活性氧分子的代謝平衡和保護機體免受活性氧損傷等方面起著重要的作用［3-5］。因此，研究水生生物體內(nèi)SOD 酶的表達量對水產(chǎn)動物養(yǎng)殖、疾病防治、生態(tài)環(huán)境保護等方面具有重要意義。李華等［6］、葉建生等［7］研究表明，鹽度對凡納濱對蝦血清中SOD 酶活力影響顯著。

口蝦蛄Oratosquilla oratoria 隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科、口蝦蛄屬，常棲息于泥沙底質(zhì)，在中國沿海均有分布。口蝦蛄味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種經(jīng)濟價值較高的水產(chǎn)品。目前，對口蝦蛄的研究主要集中在生物學基礎特征、群體結(jié)構(gòu)、提取物的醫(yī)藥作用等方面［8-13］。劉海映等［14］研究了鹽度對口蝦蛄生長和存活的影響，指出大連沿海口蝦蛄的生存鹽度為20 ～40，最適鹽度為24 ～36。培育口蝦蛄Z9 ～Z11 期假溞狀幼體的適宜鹽度為27 ～33［15］。目前，有關(guān)在鹽度脅迫下，口蝦蛄功能基因表達的研究尚未見報道。本研究中，采用實時定量PCR 技術(shù)檢測了口蝦蛄在不同鹽度脅迫和不同脅迫時間下，Mn-SOD 基因的表達情況，旨在為口蝦蛄的育苗工作提供參考，同時也為研究口蝦蛄對鹽度的調(diào)節(jié)適應機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用口蝦蛄取自遼寧盤錦光合蟹業(yè)水產(chǎn)有限公司，為土池育苗的Z9 ～Z11 期口蝦蛄。

試劑和引物主要有:動物總RNA 提取試劑盒(天根生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄和實時定量相關(guān)試劑(寶生物公司);PCR 引物(大連萬澤貿(mào)易有限公司)、DL2000Marker(生工生物公司)、dNTP、Hotstart DNA Polymerase(生工生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗共設置8 組，鹽度分別為12.8、16.3、19.8、23.3、26.8、30.3、33.8、37.3(26.8 為海水鹽度，設為對照組)，每個鹽度組約放100 只口蝦蛄。于鹽度脅迫后的1.5、3、6、9、12、24、36、48、72 h，分別從每個鹽度組取8 只口蝦蛄，浸泡于RNA 液中，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 從每個脅迫鹽度組的各個脅迫時間點采集的樣品中隨機取兩只口蝦蛄，按試劑盒說明書步驟提取總RNA。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量，用紫外分光光度計測定RNA 的濃度。使用PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:1 μL 總RNA、2 μL 5×PrimeScript buffer(for Real Time)、0.5 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、0.5 μL 1×OligodT Primer(50 μmol/L)、0.5 μL 1×Random 6 mers(100 μmol/L)，用RNase-free 水定容至10 μL。反應在PCR 儀上進行，先于37 ℃下反應15 min，再于85 ℃下反應5 s。

1.2.3 PCR 擴增 根據(jù)大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室克隆得到的Mn-SOD 基因全長，用Primer 5.0 軟件設計定量表達引物(表1)，用β-actin 作為定量表達內(nèi)參基因［16］。將引物進行PCR 檢測，篩選出條帶單一、無二聚體的引物，用于下一步的試驗。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

反應體系為:1 μL cDNA、0.5 μL 正向引物、0.5 μL 反向引物、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)、2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、0.2 μL Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、18.30 μL 滅菌蒸餾水。Mn-SOD 反應條件:94 ℃下預變性4 min;94 ℃下變性30 s，退火1 min，退火溫度分別為54、55、56、57、58、59 ℃，72 ℃下延伸5 min，共進行35 個循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min，于4 ℃下保溫。β-actin 的反應條件同上，退火溫度分別為66、67、68、69、70、71 ℃。用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶最亮時的溫度即為最佳退火溫度。

1.2.4 Mn-SOD 基因的定量表達分析 利用引物SOD-F和SOD-R 對樣品進行實時定量PCR 擴增，用β-actin-F和β-actin-R 作為內(nèi)參引物。PCR 反應條件為:94 ℃下預變性5 min;94 ℃下變性30 s，57 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸60 s，共進行30個循環(huán);最后在72 ℃下再延伸5 min，于4 ℃下保溫。對于任意一個樣品，目標基因(Mn-SOD)和內(nèi)參基因(β-actin)擴增時加入等量的模板。每個樣品設3 個平行，試驗過程重復3次，利用2-ΔΔCt法分析其定量表達結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用ABI Real-Time 軟件進行分析。Mn-SOD基因表達的相對濃度計算公式為

其中:Ct 為熒光信號達到設定域值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);CtA、CtB分別為目的基因、參照基因的Ct 值;ExA、ExB分別為目的基因、參照基因的擴增效率。

基因表達量結(jié)果用SPSS 軟件進行顯著性分析，顯著性水平設為0.05，極顯著水平設為0.01。

2 結(jié)果

2.1 口蝦蛄的總RNA

從口蝦蛄肌肉組織中提取總RNA，在紫外分光光度計上進行RNA 濃度測定和質(zhì)量檢驗，發(fā)現(xiàn)樣品RNA 的OD260nm/OD280nm值為1.9 ～2.1。利用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果見圖1，獲得的總RNA 質(zhì)量較高，可以進行后續(xù)試驗。

圖1 口蝦蛄總RNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The agarose gel electrophoretogram of mantis shrimp Oratosquilla oratoria

2.2 引物和內(nèi)參引物擴增的最佳退火溫度

用RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，利用已設計好的特異性引物進行擴增，所得目的片段電泳結(jié)果如圖2所示。根據(jù)條帶亮度，得到引物β-actin 的最佳退火溫度是68 ℃，引物SOD 的最佳退火溫度為57 ℃。

圖2 退火溫度篩選的引物擴增圖Fig.2 The amplification bands of the primers in gradient annealing temperature

2.3 口蝦蛄肌肉組織中Mn-SOD 基因的表達

2.3.1 不同鹽度脅迫對Mn-SOD 基因表達的影響不同鹽度脅迫對口蝦蛄Mn-SOD 基因表達的影響顯著。從表2可見:在相同脅迫時間下，各鹽度組口蝦蛄Mn-SOD 基因的表達量均與對照組有顯著或極顯著性差異(P＜0.05 或P＜0.01);在脅迫時間為12 h 內(nèi)，除鹽度16.3 組脅迫12 h、鹽度19.8 組脅迫1.5 h和3 h、鹽度23.3 組脅迫1.5 h、鹽度30.3 組脅迫9 h 外，其余各試驗組Mn-SOD基因的表達量均極顯著低于對照組(P＜0.01);當脅迫時間為24、36 h 時，除兩個低鹽度12.8和16.3 組以及鹽度19.8 組脅迫36 h、鹽度37.3 組脅迫36 h 外，其余各試驗組Mn-SOD 基因的表達量均極顯著高于對照組(P＜0.01)，在這個時間段中，與對照組鹽度差值小的23.3、30.3 鹽度組，Mn-SOD 基因的表達量均較高，其中鹽度23.3 組在脅迫時間為24、36 h 時的Mn-SOD 基因表達量分別為對照組的9.08 倍和1.97 倍;當脅迫時間達到48、72 h 時，除極低鹽度(12.8)和極高鹽度(37.3)組以及鹽度30.3 組脅迫72 h 外，其余各試驗組Mn-SOD 基因的表達量均極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.3.2 不同脅迫時間對Mn-SOD 基因表達的影響不同脅迫時間對口蝦蛄Mn-SOD 基因表達的影響顯著。從表2可見:除極高和極低鹽度組外，其余鹽度組Mn-SOD 基因的表達量均隨著脅迫時間的延長總體上呈先降低再升高再逐步降低的變化趨勢;鹽度為19.8、23.3、30.3、33.8 時，Mn-SOD基因最大表達量的時間點均為24 h，此時4 個鹽度組的Mn-SOD 基因表達量分別為對照組的3.82、9.08、4.84、3.41 倍;鹽度為16.3 時，不同脅迫時間對Mn-SOD 基因表達有極顯著性影響(P＜0.01)，并在12 h 時Mn-SOD 基因表達量最大，為對照組的2.85 倍;鹽度為37.3 時，Mn-SOD 基因表達量在24 h 時最大，為對照組的2.75 倍，而在其他脅迫時間點Mn-SOD 基因表達量均很低。

表2 不同鹽度脅迫、相同處理時間下Mn-SOD 基因的表達情況Tab.2 The Mn-SOD gene expression in mantis shrimp under different salinity stress

3 討論

鹽度是影響水產(chǎn)動物存活和生理反應的重要因素之一，直接影響生物的新陳代謝。研究表明，鹽度對水生生物的呼吸、體質(zhì)量、滲透壓及其組織器官的功能等均有影響［17］。本試驗結(jié)果表明，鹽度對口蝦蛄體內(nèi)Mn-SOD 基因表達量有顯著影響，尤其在極高鹽度37.3和低鹽度12.8、16.3 脅迫下，Mn-SOD 基因表達量總體上均極顯著低于對照組。這是由于試驗所用Z9 ～Z11 期口蝦蛄的培養(yǎng)鹽度為26.8，而極高和極低鹽度與試驗口蝦蛄的培養(yǎng)鹽度相差太大，鹽度脅迫可能造成了口蝦蛄生理機理紊亂、酶活性降低，從而導致Mn-SOD 基因表達量降低。在脅迫時間為1.5 h 時，各鹽度組口蝦蛄處于對周圍鹽度不適應階段，相對于高鹽度，低鹽度對Mn-SOD 基因表達量稍有促進作用。在脅迫時間為3、6 h 時，各鹽度組的Mn-SOD 基因表達量均低于對照值(除鹽度19.8 組脅迫3 h外)，推測此階段口蝦蛄對鹽度表現(xiàn)為極不適應狀態(tài)，所以基因表達量都很低。在脅迫時間為9、12 h 時，各鹽度組Mn-SOD 基因表達量有所增加，在對照值或上或下有一個高峰，這時的口蝦蛄正在逐漸適應周圍的環(huán)境。在脅迫時間為24、36 h 時，各鹽度組Mn-SOD 基因表達量在對照值上、下兩側(cè)各有一個高峰，且稍高、稍低的鹽度變化均能刺激Mn-SOD 基因的表達變化，此時的口蝦蛄對周圍環(huán)境已經(jīng)適應，對外界鹽度脅迫已做出反應。根據(jù)王瑞旋等［18］的研究，此時呼吸量的增加用于排出多余的鹽分或多余的水分來調(diào)節(jié)滲透壓，在這種滲透壓主動調(diào)節(jié)過程中，還涉及到皮膚、腸道和腎臟等器官的參與，這時需要更多的SOD 酶來減少氧自由基對機體造成的損害。在脅迫時間為48、72 h 時，各鹽度組Mn-SOD 基因的表達量又降低，均極顯著低于對照值(除鹽度30.3 組脅迫72 h外)，說明此時的口蝦蛄受鹽度脅迫時間較長，機體已受到損害，較高和較低的鹽度均不能刺激SOD 酶的增加，這時的口蝦蛄已不能再適應周圍的環(huán)境。

本試驗結(jié)果表明，鹽度脅迫時間對口蝦蛄體內(nèi)Mn-SOD 基因表達量也有顯著影響。除極高和極低鹽度組外，其余鹽度組Mn-SOD 基因的表達量均隨著脅迫時間的延長總體上呈先降低再升高再逐步降低的變化趨勢;各試驗鹽度組口蝦蛄在72 h 內(nèi)對鹽度脅迫的適應總趨勢為不適應—最不適應—逐步適應—不適應;設置鹽度與對照組差值小的組(23.3、30.3 鹽度組)，在各個脅迫時間點其Mn-SOD 基因表達量總體上高于極高和極低鹽度組。李華等［6］研究表明，凡納濱對蝦的SOD 酶等免疫生理指標呈先波動后穩(wěn)定趨勢。葉建生等［7］研究表明，鹽度突變組SOD 酶活性呈隨時間延長先降低后升高的變化趨勢，且鹽度突變值越大，SOD酶活性越小。李庭古［19］也指出，鹽度對蝦蟹類動物的影響主要是滲透壓的作用，可以通過改變自身的代謝狀況來適應不同的鹽度環(huán)境。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相近。

水生生物的整個生長過程都受其水環(huán)境中鹽度的影響。自然條件下，水環(huán)境中的鹽度表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性和晝夜波動。此外，養(yǎng)殖生產(chǎn)中定期的換水、偶爾的降雨也會導致鹽度的突然變化，這種急性鹽度脅迫對水生生物存活的影響是巨大的。此外，當生物體受到其他環(huán)境脅迫時，自由基的量會增加，要么需要更多的SOD 酶減輕毒性、維持機體氧化和抗氧化平衡，要么水生生物體不適應環(huán)境脅迫而使機體機能喪失、SOD 酶的含量降低。不僅水中的總氨氮和亞硝酸鹽氮含量會影響水生生物的SOD 免疫酶指標，而且水的鹽度對水生生物SOD 酶表達量也有很大影響，因而水生生物體內(nèi)SOD 酶的含量也是水質(zhì)量評價的一個指標。本試驗結(jié)果可為進一步了解口蝦蛄生理生態(tài)學特征提供資料，并為其養(yǎng)殖生產(chǎn)中的水質(zhì)調(diào)控、疾病預防提供科學依據(jù)。

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