pEGFP-C2-ASIC2a真核表達載體的構(gòu)建及其在大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達

倪文琳，唐 杰，潘春曉，葛金芳，陳飛虎

pEGFP-C2-ASIC2a真核表達載體的構(gòu)建及其在大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達

倪文琳，唐 杰，潘春曉，葛金芳，陳飛虎

目的通過構(gòu)建真核表達pEGFP-C2-ASIC2a質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，建立ASIC2a在關(guān)節(jié)軟骨細胞中過表達的模型，觀察ASIC2a mRNA及其蛋白在細胞中的表達。方法從大鼠腦組織中提取目的基因ASIC2a，并用EcoRⅠ和KpnⅠ進行雙酶切，同時用這兩種酶雙酶切質(zhì)粒pEGFPC2，將其酶切產(chǎn)物按常規(guī)方法連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，挑單克隆菌進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再通過雙酶切鑒定及測序后，用Lipofectamine 2000將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入關(guān)節(jié)軟骨細胞，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，使用RT-PCR和Western blot法檢測ASIC2a mRNA和蛋白表達，以鑒定模型建立成功與否。結(jié)果進行雙酶切鑒定目的條帶清晰準確，轉(zhuǎn)染后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達，通過RT-PCR可發(fā)現(xiàn)mRNA轉(zhuǎn)錄，Western blot法可發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達。結(jié)論成功構(gòu)建重組pEGFP-C2-ASIC2a表達載體，將用于進一步觀察ASICs對軟骨細胞的影響。

ASIC2a；pEGFP-C2；軟骨細胞；基因表達；蛋白表達

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于系統(tǒng)性自身性免疫性疾病，是一種以慢性、多關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥，關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的病因不明的全身性臨床疾病。在RA發(fā)展過程中，軟骨與骨組織的破壞是導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙的重要因素。研究［1］表明，炎性滑液的低pH值及其引發(fā)的軟骨細胞過度凋亡是導(dǎo)致軟骨基質(zhì)無法修復(fù)和再生的重要原因，糾正低pH環(huán)境導(dǎo)致的病理損傷成為RA防治的靶點之一。有研究［2－4］表明，酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）對細胞外酸化環(huán)境敏感，受H＋門控（ASIC4除外），激活的ASICs導(dǎo)致胞外Na＋、Ca2＋內(nèi)流并激發(fā)各種病理效應(yīng)，在炎癥、腫瘤、癲癇等以組織酸化為主要病理特征的疾病中發(fā)揮重要作用。關(guān)于ASIC2a在RA中的作用尚不明確，該研究通過構(gòu)建真核表達pEGFP-C2-ASIC2a質(zhì)粒，通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)，建立ASIC2a過表達模型，以期為進一步闡明ASICs在RA中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠8只，清潔級，體重（160± 20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑真核表達重組質(zhì)粒pEGFP-C2（由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)教研室都建老師饋贈）；大鼠軟骨細胞（原代提?。?、DH5α感受態(tài)細胞為安徽省天然藥物活性研究重點實驗室保存。胰蛋白酶、高糖DMEM液體培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）；EcoRⅠ、KpnⅠ內(nèi)切酶（Fermentas生物工程公司，加拿大）；SolutionⅠ（TaKaRa公司，加拿大）；Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol Reagent（Invitrogen公司，美國）；ASIC2a一抗（Alomone公司，以色列）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，加拿大）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.3目的基因ASIC2a cDNA的擴增制備根據(jù)目的基因序列，根據(jù)引物設(shè)計PCR特異性引物，上游引物序列：5′-CGGAATTCATGGACCTCAAGGAGAGCCCC-3′；下游引物：5′-CGGGTACCTCAGCAGGCAATCTCCTCCAG-3′，上、下游引物分別引入酶切位點EcoRⅠ、KpnⅠ及保護性堿基，并保持ASIC2a閱讀框正確；所有引物由上海英濰捷基技術(shù)有限公司合成。擴增長度為1 581 bp。β-actin引物上游為5’-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3’，引物下游為5’-AGAGGTTTACGGATGTCAACG-3’作為內(nèi)參。ASIC2a cDNA PCR擴增條件：buffer 4 μl，dNTP 2 μl，上、下游引物各1.5 μl，TaqLA酶1 μl，模板3 μl，剩下的用無酶水補足；反應(yīng)條件：94℃變性5 min；94℃1 min，61℃1 min，72℃1.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min，獲得目的片段。用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收，然后用限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ對T載體進行酶切。將回收后的PCR產(chǎn)物和酶切后的T載體用SolutionⅠ進行連接（16℃，1.5 h）。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌DH5a感受態(tài)后，挑取單菌落進行擴增，提取質(zhì)粒并用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切連接產(chǎn)物，跑膠回收目的條帶，以同樣的方法對表達載體進行雙酶切，與回收PCR產(chǎn)物以同樣條件連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5a，挑選單克隆擴大培養(yǎng)，提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后用0.1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果。將酶切正確的結(jié)果送上海英濰捷基技術(shù)有限公司測序。

1.4 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞原代、傳代培養(yǎng)與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

1.4.1 細胞準備 SD大鼠股動脈放血處死，取后肢關(guān)節(jié)軟骨細胞，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得原代軟骨細胞，1周后用胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中細胞生長至80%～90%時進行轉(zhuǎn)染實驗，試驗分3組：正常組、空載體組、過表達組。

1.4.2 鼠源pEGFP-C2-ASIC2a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠軟骨細胞 軟骨細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d將對數(shù)生長期的軟骨細胞消化計數(shù)（密度為2×105/孔），種于6孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后細胞生長至80%～90%，分別將4 μg質(zhì)粒和4 μl脂質(zhì)體溶于150 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基中，5 min后將兩者混合室溫靜置20 min；用PBS洗滌細胞2次后加入1.7 ml OPTI-MEM，再逐滴加入質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃，置37℃、5%CO2培養(yǎng)5 h，然后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染后6、12、24 h在熒光顯微鏡下觀察，實驗中同時空載體組作為對照。

1.5 過表達模型的鑒定

1.5.1 轉(zhuǎn)染24 h后利用RT-PCR法檢測細胞中ASIC2a的基因表達 取轉(zhuǎn)染后細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，分光光度計法測量RNA的濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μl：總RNA 8 μl、Oligo（dT）1 μl、Nuclease-free水補至12 μl，65℃孵育5 min、冰上冷卻5 min后加5×Reaction Buffer 4 μl、RNase inhibitor 1 μl、10 mol/L dNTPMix 2 μl、RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase 1 μl，混勻后42℃孵育60 min，70℃加熱5 min。設(shè)計PCR擴增ASIC2a的引物序列，上游引物：5′-ACTGTCTCTGCAGGACACCCT-3′；下游引物：5′-CACAGGTGCTCATGTTCTCAT-3′，擴增長度378 bp；PCR體系Mix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl剩余用無酶水補足25 μl。

1.5.2 轉(zhuǎn)染24 h后利用Western blot法檢測細胞中ASIC2a的蛋白表達 轉(zhuǎn)染24 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉非特異性結(jié)合位點，TBST洗膜后，分別用β-actin、ASIC2a的一抗孵育（抗體稀釋濃度分別為1∶10 000、1∶4 500），4℃封閉過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠和抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL發(fā)光劑反應(yīng)30 s，電腦顯影成像，實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以α＝0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 ASIC2a基因的擴增如圖1所示，瓊脂糖電泳結(jié)果表明，在1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，目的基因為1 581 bp。

圖1 ASIC2a基因PCR擴增結(jié)果

2.2 ASIC2a與T載體和pEGFP-C2載體的連接與酶切ASIC2a與T載體連接后雙酶切，出現(xiàn)目的條帶和空載體條帶，再將目的條帶進行膠回收后與pEGFP-C2連接、雙酶切，出現(xiàn)目的條帶和空載體，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果表明所擴片段與目的片段呈高度同源性，提示所構(gòu)建的質(zhì)粒是可以使用的，見圖2～5。

圖2 ASIC2a與T載體連接后重組質(zhì)粒條帶

圖3 ASIC2a與pEGFP-C2載體連接后重組質(zhì)粒條帶

圖4 與T載體酶切鑒定結(jié)果

圖5 與pEGFP-C2載體酶切鑒定結(jié)果

2.3 pEGFP-C2-ASIC2a轉(zhuǎn)染進入軟骨細胞后ASIC2a后表達情況

2.3.1 熒光顯微鏡下觀察pEGFP-C2-ASIC2a在軟骨細胞中的表達 在轉(zhuǎn)染6、12、24 h后觀察即可見綠色熒光細胞，pEGFP-C2載體在細胞中呈現(xiàn)彌散性分布表達，且24 h效果最明顯，見圖6。

圖6 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達 ×400

2.3.2 pEGFP-C2-ASIC2a轉(zhuǎn)染細胞后ASIC2a的基因表達情況 RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，空質(zhì)粒pEGFP-C2對照組ASIC2a的mRNA表達與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而pEGFP-C2-ASIC2a轉(zhuǎn)染組ASIC2a基因的轉(zhuǎn)錄明顯高于正常細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝110.709，P＜0.01），見圖7、8。

圖7 RT-PCR法檢測ASIC2a、β-actin mRNA的表達

圖8 ASIC2a mRNA的相對表達水平

2.3.3 pEGFP-C2-ASIC2a轉(zhuǎn)入細胞后的蛋白表達情況的檢測 經(jīng)Western blot法檢測顯示：ASIC2a轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒pEGFP-C2對照組的細胞內(nèi)均有ASIC2a蛋白表達，轉(zhuǎn)染后ASIC2a蛋白的表達明顯高于正常組和空載體轉(zhuǎn)染細胞（F＝245.32，P＜0.01），見圖9、10。

3 討論

pEGFP-C2是能夠表達綠色熒光蛋白的真核表達質(zhì)粒，可以在熒光顯微鏡下進行觀察，具有易轉(zhuǎn)染真核細胞的特點，且以pEGFP為報告基因的表達載體具有檢測方便、熒光穩(wěn)定、對宿主細胞無任何毒害、不影響目的蛋白的生物活性等優(yōu)點［5］。鑒于T載體可以提高克隆的穩(wěn)定性，提高連接的成功率［6］，本研究將目的基因ASIC2a與T載體連接后再與表達載體pEGFP-C2連接，通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)，建立ASIC2a過表達模型。雙酶切鑒定與測序以及RT-PCR與Western blot法結(jié)果均表明目的基因ASIC2a表達升高，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖9 Western blot法檢測ASIC2a蛋白的表達

圖10 ASIC2a蛋白的相對表達水平

RA是一種不明病因，以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要臨床癥狀的自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性介質(zhì)導(dǎo)致pH值的降低是RA發(fā)病的主要原因之一，可引起侵蝕性外周滑膜炎，繼而導(dǎo)致滑膜組織增生，軟骨細胞過度凋亡。機體可以通過ASICs感受胞外pH的變化［7］。本課題組前期研究［8］證實在佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞上廣泛表達ASIC1a、ASIC2a和ASIC3，并且ASIC1a已被證明參與酸激活介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流導(dǎo)致的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡并且已經(jīng)通過建立ASIC1a的沉默和過表達的模型證實ASIC1a在酸誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡中的作用。然而，對于ASIC2a及其他亞基在RA中的作用尚不明確。文獻［9-10］報道，上調(diào)ASIC2a可達到缺血預(yù)處理對腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用，ASIC2a對Ca2＋的滲透和質(zhì)子濃度的改變有相對較低的敏感性，且ASIC2a的上調(diào)表達與抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-w有相似的表達模式。ASIC2a敲除則可導(dǎo)致C6膠質(zhì)細胞瘤細胞Ca2＋內(nèi)流增加［11］，提示ASIC2a表達改變也可以影響ASICs對酸的敏感性和Ca2＋的通透性，參與腦缺血等疾病的發(fā)病。本研究成功構(gòu)建了pEGFP-C2-ASIC2a真核表達載體并建立大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASIC2a過表達模型，本研究的開展將有助于進一步研究ASIC2a在RA發(fā)病中的作用，為尋找RA的治療靶標提供依據(jù)。

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Construction of pEGFP-C2-ASIC2a eukaryotic expression vector and its expression in articular cartilage cells of rats

Ni Wenlin，Tang Jie，Pan Chunxiao，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo construct eukaryotic expression vector of acid sensing ion channel-2a（ASIC2a），and transfect it into the articular cartilage cells of rats to make the model of overexpression of ASIC2a.MethodsGot the cDNA of ASIC2a from rat brain，then ASIC2a cDNA was amplified by PCR and cut with double enzyme EcoR I and Kpn I，then inserted into the eukaryotic expression vetor pEGFP-C2.The recombinant vector was verified by PCR，restriction enzymes cut and sequencing identified.We used Lipofectamine 2000 transfection reagent to transfect the plasmid into the cartilage cells of rats，then observed GFP expression under the fluorescence microscope.We also determined the relative expression of the mRNA and protein of ASIC2a by RT-PCR and Western blot to identify whether the model of overexpression was constructed successfully.ResultsThe plasmid was identified by enzyme cutting where the purpose gene was included，and the electrophoretic stripes were accurate and distinct，also GFP could be detected in the transfected the articular cartilage cells of rats.ASIC2a gene expression could be detected by PCR，also its protein expression was detected by Western blot.ConclusionThe model of overexpression is constructed successfully which can be used to observe the effect on cartilage cells of the acid sensing ion channels expression.

ASIC2a；pEGFP-C2；chondrocytes；gene expression；protein expression

R 593.22

A

1000－1492（2014）03－0304－05

2013－08－26接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81271949）

安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

倪文琳，女，碩士研究生；陳飛虎，男，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydcfh＠163.com