電針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子Slit1的影響?

杜 旭，王瑞輝，王孟林，張曉芹，胥 冰，胡 薇

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

周圍神經(jīng)損傷是指周圍神經(jīng)干或其分支受到外界直接或間接力量作用而發(fā)生的損傷，屬中醫(yī)“痿證”范疇，臨床上已屬于針灸病譜中神經(jīng)系統(tǒng)的第三大疾病[1]。顯微外科修復(fù)手術(shù)、細(xì)胞移植等技術(shù)，激素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等藥物的應(yīng)用，均不能使本病的神經(jīng)功能恢復(fù)達(dá)到理想狀態(tài)[2]。而大量研究表明，電針療效顯著，能明顯提高本病患者患肢肌力，促進(jìn)功能恢復(fù)，減輕后遺癥[3～7]，其機(jī)理尚未完全闡明。周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其關(guān)鍵是軸突的再生修復(fù)，而損傷的軸突須賴神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子的引導(dǎo)，向正確的方向和途徑延伸，才能準(zhǔn)確伸入相應(yīng)靶器官，最終完成再生修復(fù)。本文將觀察其中一種導(dǎo)向因子-Slit1在電針治療下的動(dòng)態(tài)變化，以期為電針治療周圍神經(jīng)損傷提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SD大鼠72只，雌雄各半，每天體質(zhì)量200±20g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常組、模型組和治療組各24只。

1.2 儀器與試劑

兔抗鼠Slit-1多克隆一抗(Santa Cruz Biotechnology)、SP免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、G6805- C型電針機(jī)(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)。

1.3 模型制作

動(dòng)物用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。行右后肢背側(cè)縱切口，無(wú)菌條件下暴露并游離坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下10 mm處將其銳性橫斷，兩斷端用10～0顯微縫合絲線端對(duì)端縫合外膜3針，保持吻合口無(wú)張力，最后分層縫合肌肉和皮膚。

1.4 處理方法

治療組動(dòng)物造模后第2天，取“環(huán)跳”(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣)、“足三里”(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm)，0.19 mm×10 mm針灸針進(jìn)針0.5 mm后進(jìn)行電針治療(疏密波，5 Hz，強(qiáng)度以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為度)，每天1次，每次15 min，7 d為1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程；模型組不做治療，但與治療組同樣進(jìn)行動(dòng)物抓取；正常組不做任何處理。

1.5 標(biāo)本制備

分別于第1～3療程結(jié)束后當(dāng)天，將各組中8只大鼠用過(guò)量水合氯醛經(jīng)腹腔注射深度麻醉，開(kāi)胸從左心室插管至升主動(dòng)脈，先快速灌注生理鹽水約100 ml，隨后灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液300 ml，持續(xù)30 min。快速切開(kāi)，暴露坐骨神經(jīng)損傷區(qū)和相應(yīng)節(jié)段脊柱區(qū)，嚴(yán)格無(wú)菌操作下取出坐骨神經(jīng)(縫合處近、遠(yuǎn)端各約1 cm，共約2 cm)和相應(yīng)節(jié)段脊髓(L4-L6段，約2 cm)組織。

1.6 免疫組化檢測(cè)

將所取組織置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液內(nèi)固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)縱(坐骨神經(jīng))、橫(脊髓)切片(片厚5 μm)。采用SP法常規(guī)染色。每組8例，每例檢測(cè)3張切片，采用Zeiss ImergerA1顯微鏡和DXM1200F CCD圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，光鏡下Slit1陽(yáng)性反應(yīng)物為突出背景的棕黃色顆粒，用圖像分析系統(tǒng) Image-Pro Plus5.1 測(cè)定其積分光密度。

1.7 RT-PCR檢測(cè)

將所取組織用冰凍生理鹽水沖洗后迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。登錄http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得Slit1全序列，Primer5設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。slit1上游引物序列：5’- TGTGAAGCACGACTGTGTCA -3’；下游引物序列：5’- TAGCCCTCAGCACAGAGACA -3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度312bp。內(nèi)參β-actin上游引物序列：5’- TCAGGTCATCACTATCGGCAAT -3’；下游引物序列：5’- AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度432bp。首先用Trizol抽提總mRNA，以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)先合成cDNA，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃先變性5 min，然后94 ℃30 s，60 ℃45 s，72 ℃40 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃10 min。RT-PCR產(chǎn)物電泳后用JS-680C全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(上海培清)分析掃描，經(jīng)SensiAnsys凝膠圖像分析軟件對(duì)每個(gè)電泳條帶進(jìn)行光密度值測(cè)定，將測(cè)定的光密度值與相應(yīng)內(nèi)參光密度值比較，所得比值作為Slit1mRNA相對(duì)表達(dá)水平的參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

模型組與正常組比較，大鼠損傷坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段(L4-L6)中Slit1蛋白積分光密度在第1療程后達(dá)到高峰之后逐漸降低，但仍高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明坐骨神經(jīng)損傷后坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中Slit1 蛋白表達(dá)增加，高于正常水平。治療組與模型組比較，除第3療程后脊髓相應(yīng)段中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P<0.05)，有同樣的趨勢(shì)，說(shuō)明電針治療能明顯增強(qiáng)損傷坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中Slit1蛋白的表達(dá)(見(jiàn)表1、圖1、圖2)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

模型組與空白組比較，大鼠損傷的坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段(L4-L6)中Slit1 mRNA /β-actin mRNA光密度比值在第1療程后達(dá)到高峰之后逐漸降低，但仍高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明坐骨神經(jīng)損傷后坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段(L4-L6)中Slit1mRNA表達(dá)增加，高于正常水平。電針組與模型組比較，有同樣的趨勢(shì)，說(shuō)明治療能明顯增強(qiáng)損傷的坐骨神經(jīng)中Slit1mRNA的表達(dá)(見(jiàn)表2、圖3、圖4)。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)和脊髓(L4-L6)Slit1蛋白積分光密度(IOD)比較

注：與正常組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★P<0.05，★★P<0.01

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)坐骨神經(jīng)和脊髓(L4-L6)Slit1/β-actin mRNA光密度(OD)比值比較

注：與正常組比較：▲▲P<0.01；與模型組比較：★★P<0.01

圖1 各組坐骨神經(jīng)Slit1蛋白的表達(dá)(免疫組化)

圖2 各組脊髓(L4-L6)Slit1蛋白的表達(dá)(免疫組化)

圖3 各組坐骨神經(jīng)Slit1mRNA的表達(dá)(RT-PCR)注：A.第1療程結(jié)束后；B.第2療程結(jié)束后；C.第3療程結(jié)束后；1.正常組；2.模型組；3.治療組

圖4 各組脊髓(L4-L6)Slit1mRNA的表達(dá)(RT-PCR)注：A.第1療程結(jié)束后；B.第2療程結(jié)束后；C第3療程結(jié)束后；1.正常組；2.模型組；3.治療組

3 討論

自1928年Cajal就提出“神經(jīng)趨向性”(neurotropism)概念直至上世紀(jì)90年代中后期?，F(xiàn)已證實(shí)，有4種重要的軸突生長(zhǎng)導(dǎo)向分子家族，即Netrins、Slits、Semaphorins和Ephrins[8]，可分為吸引性因子和排斥性因子兩類。它們通過(guò)接觸吸引、接觸排斥和化學(xué)吸引、化學(xué)排斥來(lái)調(diào)節(jié)軸突靶向生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致軸突內(nèi)細(xì)胞骨架的重排，實(shí)現(xiàn)對(duì)生長(zhǎng)錐延伸的精確引導(dǎo)，即軸突引導(dǎo)(axon guidance)[9]。Slits為代表性的排斥性因子，分子量170～190 KD，主要由胚胎脊髓聯(lián)合纖維發(fā)育期中樞中線底板處星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌[10]。在哺乳動(dòng)物中，Slit1、Slit2在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)廣泛，Slit3則存在于海馬，其受體Roundabou(Robo)在神經(jīng)元軸突上表達(dá)。Slit蛋白具有排斥運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突和促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)纖維分支和延伸的雙重作用，性質(zhì)取決于其本身和受體[11]。Slit可以和表達(dá)于軸突表面即原生質(zhì)胞膜上的Robo結(jié)合，引起一系列信號(hào)傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排，引導(dǎo)生長(zhǎng)錐延伸至正確的方向[12～15]。已有學(xué)者認(rèn)為，Slit對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元周圍突起的作用比中樞突更為敏感[16]?？梢?jiàn)，生長(zhǎng)錐的導(dǎo)向就是神經(jīng)再生和發(fā)育最為關(guān)鍵和精細(xì)的環(huán)節(jié)之一，高度敏感的生長(zhǎng)錐是神經(jīng)再生的真正前沿。迄今為止，未見(jiàn)PubMed及國(guó)內(nèi)有電針治療周圍神經(jīng)損傷是否影響Slit表達(dá)的論文發(fā)表。

本證屬于中醫(yī)學(xué)“痿證/病”范疇，病機(jī)主要以氣血不足、營(yíng)衛(wèi)不調(diào)為主，臨床治療以“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”為原則。故本實(shí)驗(yàn)選足少陽(yáng)膽經(jīng)的“環(huán)跳”和足陽(yáng)明胃經(jīng)的“足三里”穴，因?yàn)椤碍h(huán)跳”是足少陽(yáng)膽經(jīng)與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，是治療下肢痿痹的要穴；“足三里”是胃經(jīng)合穴、下合穴，也是治療下肢痿痹、半身不遂等經(jīng)絡(luò)痹阻病癥的要穴，即“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”。研究表明，針刺治療坐骨神經(jīng)痛使用頻次最高的為環(huán)跳，足三里頻次也極高[17]；電針“環(huán)跳”和“委中”能有效減少神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓相應(yīng)節(jié)段脊髓興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放，促進(jìn)抑制性氨基酸遞質(zhì)的釋放[18]；電針能明顯改善結(jié)扎坐骨神經(jīng)造成慢性壓迫性損傷大鼠的痛敏狀態(tài)，顯著降低損傷側(cè)脊髓背角膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)活性和促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)mRNA的表達(dá)[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取此兩穴配合使用，以疏調(diào)經(jīng)絡(luò)之氣、活血止痛，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷再生與修復(fù)并探究其可能的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SD大鼠坐骨神經(jīng)切斷即刻外膜端對(duì)端縫合后應(yīng)用電針治療，在3個(gè)療程(7 d、14 d、21 d)結(jié)束后，損傷的坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段(L4-L6)中Slit1 蛋白及其mRNA表達(dá)，除第3療程后脊髓相應(yīng)段中外，其他差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明電針治療可能就是通過(guò)增強(qiáng)損傷坐骨神經(jīng)和相應(yīng)脊髓段中Slit1蛋白及其mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)臨床治療作用。但如何影響Slit1蛋白及其mRNA的表達(dá)則是一個(gè)非常復(fù)雜的問(wèn)題，應(yīng)與其受體Robo有關(guān)，可能還牽涉到其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等影響軸突、神經(jīng)修復(fù)再生的眾多因素及復(fù)雜的相互關(guān)系，還缺乏全面、綜合的研究。最新研究表明，大鼠坐骨神經(jīng)橫斷傷(SNT)后Robo1、Robo2mRNA和Robo1在背根神經(jīng)節(jié)中第3天表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，高峰在第7天至第14天之間，第21天后回歸低水平，這提示Robo1 通過(guò)在SNT后的上調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐遷移，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)纖維的延伸[20]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，而電針對(duì)Robo1、Robo2mRNA是否有影響就值得進(jìn)一步探究。總之，電針能促進(jìn)Slit1蛋白及其mRNA的表達(dá)，可能是其促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)再生的一個(gè)方面，其具體機(jī)制則需進(jìn)一步的研究，最終將為全面揭示電針治療周圍神經(jīng)損傷提供新的科學(xué)依據(jù)。

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