一株野油菜黃單胞菌產(chǎn)黃原膠的性質(zhì)

張建國(guó)，黃勛娟

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

一株野油菜黃單胞菌產(chǎn)黃原膠的性質(zhì)

張建國(guó)，黃勛娟

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

通過(guò)發(fā)酵一株野油菜黃單胞菌得到黃原膠，進(jìn)而測(cè)定該黃原膠在不同質(zhì)量濃度、pH值、氯化鈉質(zhì)量濃度、溫度下黏度變化，分析黃原膠流變特性、丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黏均分子質(zhì)量。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)菌株的黃原膠產(chǎn)量達(dá)到28.4 g/L，黃原膠黏度在質(zhì)量濃度高于4.0 g/L時(shí)迅速升高，黃原膠黏度在pH 3.0～10.0之間穩(wěn)定。氯化鈉質(zhì)量濃度由10 g/L增加到70 g/L時(shí)，使1.0 g/L黃原膠黏度提高20%，而溫度高于35 ℃時(shí)使1.0 g/L黃原膠黏度降低。黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6.35%，黏均分子質(zhì)量為5.7×106D。1.0 g/L黃原膠的稠度系數(shù)和流體指數(shù)分別為26.94和0.765 5，5.0 g/L黃原膠的稠度系數(shù)和流體指數(shù)分別為489.65和0.328 1。研究表明該株野油菜黃單胞菌具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

野油菜黃單胞菌；黃原膠；黏度；假塑性流體；丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

黃原膠，又名漢生膠，具有優(yōu)良的水溶性、增稠性和流變性。早在1969年被美國(guó)食品藥品管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)為食品中不限量添加劑。至今，黃原膠已經(jīng)被廣泛用于食品[1]、化妝品、化工[2]、農(nóng)藥[3]等行業(yè)中。尤其在食品行業(yè)中對(duì)淀粉糊化[4]、干酪的質(zhì)構(gòu)[5]、肉制品的品質(zhì)[6]等諸多方面有顯著的效果。黃原膠的結(jié)構(gòu)由5 個(gè)糖分子（兩個(gè)葡萄糖、兩個(gè)甘露糖、一個(gè)葡萄糖醛酸）和乙酸、丙酮酸組成的重復(fù)單元。其中，兩個(gè)葡萄糖分子以β-1,4-糖苷鍵相連作為主鏈，剩下的3 個(gè)糖分子作為支鏈。支鏈中葡萄糖醛酸處于中間位置，兩端是甘露糖分子?？拷麈湹母事短菚?huì)被乙酰基修飾，末端的甘露糖和丙酮酸發(fā)生縮醛反應(yīng)。黃原膠分子質(zhì)量在2×106～2×107D之間。乙酸、丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和三糖支鏈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同會(huì)導(dǎo)致黃原膠性質(zhì)的差異[7]。另外，黃原膠在溶液中的構(gòu)象不同也影響黃原膠性質(zhì)。不同的黃原膠產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的黃原膠組分和性質(zhì)也不同[8]。黃原膠的主要生產(chǎn)菌是野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris），另外被報(bào)道的產(chǎn)生菌還有草莓角斑病菌（Xanthomonas fragaria）、甘藍(lán)黑腐黃單胞菌變種（Xanthomonas gummisudans）等。培養(yǎng)條件不同也是導(dǎo)致黃原膠的組分和性質(zhì)出現(xiàn)差異的重要因素，例如培養(yǎng)基的碳源、氮源、pH值、溫度都影響黃原膠的生產(chǎn)效率和性質(zhì)[9]。本研究分析了一株野油菜黃單胞菌所產(chǎn)黃原膠的性質(zhì)，表明該菌可以產(chǎn)生性質(zhì)優(yōu)良的黃原膠，具有較大潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

野油菜黃單胞菌為上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、2,4-二硝基苯肼等均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

NDJ-5S旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì) 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；UV752紫外分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)野油菜黃單胞菌生產(chǎn)黃原膠

野油菜黃單胞菌首先接種到種子培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、牛肉膏0.5 g/L、蛋白胨 3.0 g/L、酵母粉1.0 g/L），然后在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。將種子培養(yǎng)基以5%接種量轉(zhuǎn)接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖45.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、碳酸鈣3.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂2.5 g/L、硫酸亞鐵0.25 g/L、檸檬酸0.25 g/L，pH 7.0），在28 ℃、180 r/min培養(yǎng)120 h。

在50 mL發(fā)酵液中加入100 mL的95%乙醇，室溫下攪拌30 min，過(guò)濾分離乙醇，再加入發(fā)酵液50 mL乙醇攪拌過(guò)濾。將得到的黃原膠置于烘箱中60 ℃烘至恒質(zhì)量，最后稱黃原膠的質(zhì)量。

1.3.2 黃原膠的黏度分析

稱取一定量的黃原膠，在25 ℃時(shí)溶解于去離子水中。利用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。鹽質(zhì)量濃度用氯化鈉質(zhì)量濃度表示。測(cè)量黏度時(shí)利用水浴鍋控制溫 度。利用旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)選擇合適的轉(zhuǎn)子，將轉(zhuǎn)子浸入黃原膠溶液中，黏度所占的百分比在10%～100%之間。

1.3.3 假塑性流體參數(shù)的計(jì)算

利用黏度計(jì)測(cè)定不同轉(zhuǎn)速時(shí)的黏度，根據(jù)公式（2）得到K和n。

式中：τ為剪切力/mPa；γ為剪切速率/min－1；K為稠度系數(shù)；n為流體指數(shù)。

1.3.4 丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

以1 mol/L鹽酸為溶劑，配制20.0 g/L的黃原膠溶液。在100 ℃條件下水解3 h。然后取50 μL水解液，加入0.25 mL 2.0 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液，搖勻。再加入5 mL 1.5 mol/L氫氧化鈉溶液，生成紫紅色2,4-二硝基苯腙衍生物顯色，在520 nm波長(zhǎng)處比色，計(jì)算黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]。

1.3.5 黏均分子質(zhì)量計(jì)算

高聚物在稀溶液中的黏度是高聚物在流動(dòng)過(guò)程內(nèi)摩擦的反映，可以按照公式（4）、（5）、（6）推導(dǎo)出公式（7）、（8）。

利用公式（7）、（8）擬合黃原膠質(zhì)量濃度接近0時(shí)的特性黏度[η]，再利用公式（9）計(jì)算出黏均分子質(zhì)量。

式中：η為表觀黏度/（mPa·s）；η0為純?nèi)軇┑酿ざ?（mPa·s）；ηsp為增比黏度/（mPa·s）；ηr為相對(duì)黏度/（mPa·s）；[η]為特性黏度/（mPa·s），反映無(wú)限稀溶液中高聚物分子與溶劑分子之間的內(nèi)摩擦；ρ為黃原膠質(zhì)量濃度/（g/L）；M為黃原膠分子質(zhì)量的平均值/D；K為比例常數(shù)；α為與黃原膠在溶液中的形態(tài)有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)Mark-Houwink參數(shù)查閱文獻(xiàn)[11-12]?。害?1.140、K=0.000 17 mL/mg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有分析實(shí)驗(yàn)都是重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)取平均值。利用SPSS 13.0對(duì)黃原膠黏度在不同pH值時(shí)的波動(dòng)，以及在不同溫度時(shí)黃原膠黏度進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野油菜黃單胞菌生產(chǎn)黃原膠

圖1 野油菜黃單胞菌糖消耗和產(chǎn)黃原膠的變化曲線Fig.1 Time courses of glucose concentration and xanthan production by Xanthomonas campestris

由圖1可知，在120 h的培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖質(zhì)量濃度逐漸減少，尤其在48 h內(nèi)迅速減少。而黃原膠產(chǎn)量在初始72 h內(nèi)快速升高到27.0 g/L，72 h后產(chǎn)量緩慢增加，120 h時(shí)的產(chǎn)量達(dá)到28.4 g/L，高于一些報(bào)道的黃原膠產(chǎn)量[13]，也達(dá)到了其他研究在發(fā)酵罐上培養(yǎng)野油菜黃單胞菌生產(chǎn)黃原膠的水平[14]。

2.2 不同質(zhì)量濃度黃原膠的黏度變化

圖2 不同質(zhì)量濃度黃原膠的黏度變化Fig.2 Viscosities of xanthan at different concentrations

由圖2可知，黃原膠的黏度均隨著質(zhì)量濃度的升高而升高。黃原膠的質(zhì)量濃度在4.0 g/L以下黏度緩慢升高，質(zhì)量濃度高于4.0 g/L后黏度快速升高。黃原膠質(zhì)量濃度為9.0 g/L時(shí)的黏度為2 656.67 mPa·s。該黃原膠高黏度可以減少黃原膠的使用量。

2.3 不同pH值對(duì)黃原膠黏度的影響

圖3 pH值對(duì)黃原膠黏度的影響Fig.3 Effect of pH on the viscosity of xanthan

利用鹽酸和氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)1.0 g/L黃原膠的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。由圖3可知，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的黃原膠黏度在pH 3.0～10.0之間波動(dòng)不明顯，黏度維持在28.0 mPa·s，黃原膠黏度的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.617 mPa·s。這說(shuō)明該種黃原膠可以在較為廣闊的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

2.4 氯化鈉質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠黏度的影響

以氯化鈉分別調(diào)節(jié)1.0 g/L黃原膠的鹽質(zhì)量濃度為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 g/L。由圖4可知，1.0 g/L黃原膠的黏度隨著氯化鈉質(zhì)量濃度升高而升高，這和Whistler[15]報(bào)道的黃原膠黏度受鹽質(zhì)量濃度影響的結(jié)果一致，因?yàn)辂}離子明顯增加低質(zhì)量濃度黃原膠分子間電荷相互作用[16]。在氯化鈉質(zhì)量濃度由10 g/L增加到70 g/L時(shí)，黃原膠黏度由30.0 mPa·s升高到36.0 mPa·s，上升了20.0%。

圖4 氯化鈉質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠黏度的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on the viscosity of xanthan

2.5 溫度對(duì)黃原膠黏度的影響

圖5 溫度對(duì)黃原膠黏度的影響Fig.5 Viscosities of xanthan at different temperatures

在溫度為15.0、25.0、35.0、45.0、55.0、65.0 ℃時(shí)測(cè)量1.0 g/L黃原膠的黏度，由圖5可知，隨著溫度由15.0 ℃上升到65.0 ℃，黃原膠黏度先由32 mPa·s上升到34 mPa·s，后下降到20 mPa·s。在溫度為35 ℃時(shí)黃原膠的黏度與溫度為15、25 ℃時(shí)黃原膠黏度有顯著差異。黃原膠黏度在溫度高于35 ℃時(shí)逐漸下降，但是下降幅度（41.18%）比Desplanques等[17]報(bào)道的下降幅度小，這是因?yàn)樗褂玫狞S原膠性質(zhì)不同。較低溫度時(shí)，黃原膠分子呈現(xiàn)螺旋狀結(jié)構(gòu)，三糖支鏈以反向方式纏繞主鏈骨架，通過(guò)氫鍵維持棒狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋的黃原膠之間以非共價(jià)鍵結(jié)合形成復(fù)合體，表現(xiàn)出高黏度[18]。溫度升高時(shí)黃原膠分子由雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)，使黏度迅速下降。

2.6 黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黏均分子質(zhì)量

經(jīng)測(cè)定得，黃原膠丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.35%。黏均分子質(zhì)量為5.7×106D。丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃原膠的黏度有明顯影響，質(zhì)量濃度為10.0 g/L的高丙酮酸黃原膠（丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.29%）比普通黃原膠（丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.74%）的黏度高16.5%[19-20]。在丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.31%的黃原膠添加鉀離子增加黃原膠的黏度[21]。本實(shí)驗(yàn)中黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.35%，是目前文獻(xiàn)[22]中最接近黃原膠中飽和丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（8.69%）的報(bào)道，也符合丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的黃原膠黏度高的結(jié)果，這與聚合物黏度理論相符合[23]。

2.7 黃原膠的假塑性流體參數(shù)計(jì)算

圖6 黃原膠的假塑性流體參數(shù)Fig.6 Pseudo-plastic fluid parameters of xanthan

質(zhì)量濃度為1.0 g/L和5.0 g/L的黃原膠的稠度系數(shù)和流體指數(shù)的計(jì)算結(jié)果見圖6。黃原膠的稠度系數(shù)由1.0 g/L時(shí)的26.94上升到5.0 g/L的489.65，流體指數(shù)則由0.765 5下降到0.328 1。

3 結(jié) 論

本研究報(bào)道了一株高產(chǎn)黃原膠的野油菜黃單胞菌在100 mL裝液量的搖瓶中發(fā)酵時(shí)黃原膠產(chǎn)量達(dá)到28.4 g/L。通過(guò)分析該黃原膠黏度隨黃原膠質(zhì)量濃度、pH值、氯化鈉質(zhì)量濃度、溫度的變化，以及該黃原膠的流變性、丙酮酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黏均分子質(zhì)量，表明本研究采用的菌株具有良好的黃原膠生產(chǎn)潛力。

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Properties of Xanthan from Xanthomonas campestris

ZHANG Jian-guo, HUANG Xun-juan
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

A strain of Xanthomonas campestris was screened and cultured for the production of xanthan. Effects of xanthan concentration, pH, sodium chloride content and temperature on viscosities were determined. Rheological behaviors, pyruvate content, and molecular weight of xanthan were investigated for further application. The strain produced 28.4 g/L xanthan. The viscosity of xanthan increased rapidly when the concentration was higher than 4.0 g/L, but remained stable in the pH range of 3.0-10.0. The viscosity of 1.0 g/L xanthan was increased by 20% in response to an increase in NaCl concentration from 10 to 70 g/L, but showed a decrease at high temperature (higher than 35 ℃). The xanthan contained 6.35% pyruvate and had a viscosity-average molecular weight of 5.7 × 106D. Coeff cient and f uidity index of the xanthan prepared from Xanthomonas campestris at different concentrations were 26.94 and 0.765 5 for 1.0 g/L, and 489.65 and 0.328 1 for 5.0 g/L, respectively. In conclusion, this strain of Xanthomonas campestris has tremendous application potential.

Xanthomonas campestris; xanthan; viscosity; pseudo-plastic f uid; pyruvate content

TS202

A

1002-6630（2014）23-0029-04

10.7506/spkx1002-6630-201423006

2014-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21306112）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13ZR1429100）

張建國(guó)（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称放c微生物工程。E-mail：jgzhang@usst.edu.cn