食品中維吉尼霉素殘留檢測方法研究進展

蘭 洋，董 全

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

食品中維吉尼霉素殘留檢測方法研究進展

蘭 洋，董 全*

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

維吉尼霉素是一種環(huán)狀多肽類抗生素，常用于豬、雞等畜禽疾病的預防和治療，并能有效提高飼料利用率和動物生長速率。但食品中抗生素的殘留會引起細菌、動物與人之間產(chǎn)生交叉耐藥性，歐盟從1999年開始禁止將包括維吉尼霉素在內(nèi)的抗生素作為飼料添加劑，抗生素在動物性食品中的殘留普遍受到各國的高度重視。本文主要綜述樣品前處理技術和維吉尼霉素檢測方法，對比分析各檢測方法的優(yōu)缺點，同時也對檢測方法的發(fā)展進行展望，以期為我國對維吉尼霉素殘留的檢 測和監(jiān)管研究提供參考。

抗生素；維吉尼霉素；耐藥性；檢測方法

維吉尼霉素（virginiamycin，VGM）又叫維吉霉素、維吉尼亞霉素、肥大霉素、威里霉素、抗金葡霉素，是維吉尼鏈霉菌產(chǎn)生的一種環(huán)狀多肽類抗生素。它由M組分[1]（M1～M2）和S組分[2]（S1～S5）組成（圖1），其中M1和S1為主要成分，市售VGM通常是70%大環(huán)內(nèi)酯M1和30%環(huán)狀多肽S1的混合物。VGM為淺黃色粉末，在甲醇、氯仿、乙醇等有機溶劑中可溶解，在水、乙醚中極微溶解，在石油醚中不溶解[3]，在pH值大于9.5時其生物活性易喪失。VGM溶液對紫外光有較強的吸收性，但紫外光照射會引起其降解[4]。VGM主要作用于革蘭氏陽性細菌的核糖體，從而抑制其蛋白質(zhì)合成[3]，因此VGM常用于豬[5-6]、雞[7-8]等畜禽疾病的預防和治療，并能有效提高飼料的利用率和動物的生長速率[9]。由于VGM存在引起細菌、動物與人之間產(chǎn)生交叉耐藥性的風險，歐盟從1999年開始禁止將包括VGM在內(nèi)的抗生素作為飼料添加劑[10]。日本規(guī)定牛奶和雞蛋中VGM的最高殘留限量均為100 μg/kg[11]。我國農(nóng)業(yè)部第168號公告[12]中允許將VGM作為飼料添加劑并規(guī)定：豬飼料中的添加量為20～50 g/t；雞飼料中的添加量為10～40 g/t，休藥期均為1 d。農(nóng)業(yè)部第235號公告[13]中又規(guī)定：VGM在豬組織中的最高殘留限量為肌肉100 μg/kg、肝臟300 μg/kg、腎臟400 μg/kg，這與美國聯(lián)邦法規(guī)（Code of F ederal Regulations，CFR）的規(guī)定一致[14]；在家禽組織中的最高殘留限量為：肌肉100 μg/kg、肝臟300 μg/kg、腎臟500 μg/kg。

圖1 維吉尼霉素結構式Fig.1 Structures of virginiamycins

VGM在動物組織中主要以原形藥物狀態(tài)存在，目前各國法規(guī)沒有明確規(guī)定VGM的殘留標識物，而商業(yè)VGM產(chǎn)品以M1組分為主，所以目前主要檢測的是豬、雞等畜禽組織[15-16]和牛奶[17]中的VGM M1殘留。為保障人民的身體健康以及擴大食品的貿(mào)易往來，很有必要建立快速、經(jīng)濟、靈敏度更 高、特異性更強的檢測方法。目前VGM的檢測方法主要有微生物效價法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本文對近年來國內(nèi)外VGM檢測方法進行綜述，以期能為我國在這方面的進一步研究提供參考。

1 樣品前處理

為了提高檢測方法的靈敏度及準確度，并延長儀器的壽命，需要對樣品進行必要的前處理，使得待測物質(zhì)得以提取、凈化和濃縮，從而降低或消除基質(zhì)對檢測結果的影響。

1.1 樣品的提取

樣品的提取方法通常有液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、 超聲波輔助提?。╱ltrasonic-assisted extraction，UAE）、超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）、固相萃取（solid-pha se extraction，SPE）等。VGM的檢測研究中多用LLE法和UAE法（見表1）。根據(jù)VGM不溶于非極性溶劑的特點，通常使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等極性有機溶劑萃取。大部分研究者都采用了兩種有機溶劑進行VGM提取，但也有研究者僅采用一種有機溶劑提取。陳小霞等[11]在用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定牛奶中VGM M1時僅采用乙腈進行提取，其不同水平加標回收率為72%～90%。魏云計等[18]用同樣的方法測定雞肝中的VGM M1時，對比了乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯-0.2 mol/L NH4H2PO43 種提取溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)采用混合溶劑提取的效果最好，方法回收率為81.5%～90.3%。林維宣等[19]對比了甲醇-0.1%甲酸溶液和甲醇-NH4H2PO4溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽會對VGM等多肽類抗生素的質(zhì)譜檢測產(chǎn)生干擾，而前一種提取液得到的回收率是92%～100%，提高了方法的準確度。UAE法是近年來發(fā)展較快的樣品提取技術，具有萃取效率高、簡便快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點[20]。馮三令[21]采用該方法測定飼料中VGM的含量。得出配合飼料在3 個濃度的平均加標回收率為84.77%～95.75%，批內(nèi)和批間RSD均小于5%。

1.2 樣品凈化

牛奶、動物組織中的脂類會隨著VGM的提取同時被提取出來，故樣品凈化的主要目的是除去干擾較大的脂肪、蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)。通常采用的方法是：直接向離心或過濾得到的樣品殘渣中加入樣品提取液，再用正己 烷脫脂，最后過0.22 μm濾膜[11,22]。但是過濾困難，不利于實現(xiàn)自動化操作，而采用凈化柱則可以提高凈化速度、易于實現(xiàn)自動化。曹文卿等[23]在測定動物組織中VGM時，僅用甲醇和甲酸銨混合溶液進行液液萃取后過0.22 μm濾膜，方法的檢測限為0.5 μg/kg，平均回收率為86%～118%。魏云計等[18]則研究了HLB、C18、PSA 3 種填充柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)填充料為N-丙基乙二胺的PSA柱的回收率高于C18柱和HLB柱。Gibson等[24]用甲醇水溶液提取雞肉中的VGM，用Oasis HLB柱凈化，甲醇洗脫后過0.22 μm濾膜，得到的檢測限為0.36 μg/kg，平均回收率為90%～101%，日內(nèi)和日間變異系數(shù)分別為5.2%～12.1%和7.9%～30.3%。VGM檢測樣品的具體凈化方式見表1。

表1 維吉尼霉素檢測的樣品前處理技術Table1 Sample pretreatment techniques for the detection of virginiamycin

2 VGM的檢測方法

目前，國內(nèi)外對VGM的檢測方法有很多，但主要集中在微生物法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

2.1 微生物法

微生物法（又稱為杯碟法）是我國在VGM檢測中最早使用的一種方法，它是根據(jù)抗生素對微生物代謝和生理機能的抑制作用來對樣品中的藥物殘留進行定性或定量分析[30]。這種方法相比液質(zhì)聯(lián)用及酶聯(lián)免疫分析法，成本比較低、操作簡便，但是方法的可重復性差、靈敏度比較低，由于要進行微生物培養(yǎng)和生物自顯影的確證實驗，所以檢測用時更長，且只能檢測具有生物活性的VGM殘留。我國的行業(yè)標準SN/T 1134-2002《進出口肉及肉制品中維吉尼霉素殘留量檢驗方法》[31]中規(guī)定了用杯碟法檢測肉及肉制品中VGM殘留量方法，標準規(guī)定：用乙醇提取試樣中殘留的VGM，均質(zhì)并離心，取上清液與結膜干燥棒桿菌作用，根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈直徑大小，查閱標準曲線，從而計算樣品中VGM的殘留量。該方法的檢測限是0.05 mg/kg，0.05～0.2 mg/kg添加范圍內(nèi)的平均回收率為80%～81.3%，方法準確度比較高。

2.2 薄層色譜法

應用在VGM殘留檢測中的薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）是在1999年歐盟禁止使用VGM等抗生素后才建立起來的，該方法相比微生物法有更高的特異性，利用該方法對大量的檢樣進行初篩，再結合液相色譜等方法進行確證，可以從總體上降低檢測成本。Vincent等[32]建立了TLC結合生物自顯影技術定性檢測飼料中VGM的方法。該方法可以達到的最低定性檢出量是1 mg/kg，比歐盟規(guī)定的5 mg/kg更低，符合定性檢測的要求。但是由于該方法獨立定量檢測VGM時靈敏度不高，不能滿足越來越低的殘留限量要求，所以國內(nèi)外對該方法的研究相對較少。

2.3 高效液相色譜法

由于VGM沸點高，不適合用氣相色譜法檢測，而液相色譜不需要高溫條件，所以適合VGM的檢測。目前， 檢測VGM的主流方法是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。樣品經(jīng)過提取、脫脂、脫蛋白質(zhì)、層析凈化等步驟進行分離后用HPLC進行檢測，該方法檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好。由于反相色譜法（reversed phase HPLC，RP-HPLC）采用甲醇、乙腈等水溶性有機溶劑做流動相，不干擾檢測，采用的固定相（C8或C18）性質(zhì)穩(wěn)定，極性雜質(zhì)先流出，分析速度快，目前被廣泛采用。耿志明等[33]建立了豬組織中VGM M1殘留的RP-HPLC測定方法。用甲醇-NH4H2PO4溶液提取樣品，正己烷脫脂，C18固相萃取柱凈化，以乙腈-水為流動相，ODS-3 C18柱分離，用DAD檢測器在245 nm波長處進行檢測。結果表明：VGM M1在100～2 000 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，最低檢測限為10 μg/kg。肌肉、肝臟和腎臟組織的加標回收率均在72%～85%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均在10%以內(nèi)。

由于VGM在高于230 nm波長的光譜區(qū)無紫外吸收，因此限制了紫外檢測器的使用，而二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）可同時接收整個光譜區(qū)的信息，因此，DAD檢測器是目前國內(nèi)外采用HPLC法測定VGM的主流檢測器。Hajee等[27]在檢測家禽組織中VGM含量時對比研究了紫外檢測器在23 0 nm波長處檢測結果和質(zhì)譜儀的檢測結果，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀的檢測選擇性和靈敏度比紫外檢測器高許多。

2.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術包括液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。無論是國家標準測定方法還是近幾年國內(nèi)外的研究，都采用了LC-MS/MS法。中華人民共和國國家標準GB/T 20765—2006《豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[34]中規(guī)定了豬肝臟、腎臟、肌肉組織中VGM M1殘留的LC-MS/MS檢測方法。標準規(guī)定殘留VGM的樣品經(jīng)甲醇-乙腈溶液勻漿提取、離心，取上清液用NH4H2PO4緩沖溶液稀釋，C18固相萃取柱凈化，將洗脫液中的VGM M1用三氯甲烷分離萃取，去除水層。氮氣吹三氯甲烷至干，用甲酸氨緩沖溶液與甲醇混合液溶解并定容，用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀測定，方法的檢測限為0.25 μg/kg。中華人民共和國國家標準GB/T 229 91—2008《牛奶和奶粉中維吉尼霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]規(guī)定了牛奶和奶粉中VGM M1殘留的LC-MS/MS檢測方法。原理上相比第一個國標少了勻漿的步驟，多了將奶粉超聲溶解得到復原乳的步驟。該方法的檢測限為：原料乳0.25 μg/kg，純奶粉2.0 μg/kg。Liu Jiaji a等[28]采用LC-MS/MS法檢測牛奶中VGM M1，在樣品預處理時采用甲醇和0.1%甲酸提取，比國標多加入三氯乙酸乙腈除蛋白質(zhì)，這一方法改進使得檢測限降低至0.2 μg/kg。趙靜等[36]也采用LC-MS/MS法檢測牛奶中VGM M1，得出牛奶中VGM M1的檢測限為0.25 μg/kg，奶粉中VGM M1檢測限為2.0 μg/kg的結論，這一實驗結果和國標方法一致。

通常，不同的樣品基質(zhì)對檢測結果的影響比較大。陳小霞等[2]用乙腈提取雞肉、雞肝等樣品中的VGM，并且僅用乙腈作為流動相從而改進國標，將檢測時間縮短為10 min，在多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下進行質(zhì)譜掃描，得出定量限分別為：雞肉25 μg/kg、雞肝100 μg/kg、豬腎150 μg/kg，回收率分別為：雞肉86.8%～108%、雞肝81.8%～109%、豬腎82.7%～102%。實驗室內(nèi)相對標準偏差均小于10%。Sin等[37]將豬肌肉及內(nèi)臟采用乙腈提取VGM，在MRM模式下進行質(zhì)譜掃描，得出該方法檢測限：肌肉1.9 μg/kg、肝臟3.4 μg/kg、腎臟4.3 μg/kg；線性范圍為0～3 000 μg/kg，準確度分別為94%、102%和112%，變異系數(shù)分別為6.7%、5.1%、9.2%。de Alwis 等[26]檢測了酒糟中包括VGM M1在內(nèi)的13 種抗生素含量。樣品經(jīng)過EDTA和三氯乙酸溶液提取，再經(jīng)甲醇溶液提取，然后通過一個雙軌道親水性聚合物或弱陽離子交換固相萃取小柱凈化，再進行液相色譜/離子阱串聯(lián)質(zhì)譜分析。該方法的檢測限是0.1 μg/g，回收率是78%～104%，準確度是90%，變異系數(shù)是11%。

UPLC-MS/MS具有更快的分析速度、更高的分辨率和靈敏度。Huang Yonghui[22]建立了飼料中VGM M1的UPLC-MS/MS分析測定方法。方法的檢測限和定量限分別為2、7 μg/kg，在0.3～226.6 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，平均回收率為82.6%～102.7%，相對標準偏差為0.9%～1 0.5%。Tang等[25]采用UPLC-MS/MS檢測豬肉、雞肉及魚肉，方法的檢測限和定量限分別為1、5 μg/kg，平均回收率為52.9%～77.7%。

LC-MS/MS技術既具備高效分離的優(yōu)點，又具備定性鑒定化合物結構的能力，可同時達到定性、定量分析的目的，而且選擇性好、靈敏度高、檢測限低、抗干擾能力強，對于獸藥殘留測定的確證性分析可靠度高，從而可以避免出現(xiàn)HPLC和ELISA法檢測中的假陽性結果。然而，由于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器昂貴，又需要專業(yè)技術人員進行操作，限制了該技術的普及。

2.5 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunoso rbent assay，ELISA）是一種以抗原與抗體的結合反應為基礎的檢測方法，它結合了酶促反應的高效性和免疫反應的特異性特點，因此ELISA反應具有高度的專一性，非常低的檢測限和非常高的靈敏度，同時檢測速度快，從而適合于對VGM等獸藥進行現(xiàn)場快速定性或定量檢測。ELISA法的難點在于制備出量大、特異性強和成本較低的抗體，同時較高的試劑盒價格也限制了ELISA在獸藥殘留檢測中的應用。Situ等[1]建立了動物飼料中VGM M1檢測的ELISA法，采用70%甲醇溶液提取，用Oasis HLB柱凈化，最低檢測限和定 量限分別是0.09、0.2 mg/kg，在1、1.5、2.0 mg/kg 3 個水平上的加標回收率是127%～145%，變異系數(shù)小于18%，符合歐盟飼料中VGM殘留檢測要求。McNamee等[29]建立了家禽組織中VGM M1檢測的ELISA法。通過甲醇提取，固相凈化，然后用ELISA測定。檢測結果是：未烹飪小雞的檢測限是0.04 μg/kg，烹飪后的檢測限是0.01 μg/kg，烹飪前的回收率是102%，烹飪后的回收率是36%。相比前者飼料中VGM的ELISA檢測，檢出能力則提高了1 000倍。

綜上所述，維吉尼霉素的檢測方法種類較多，各種檢測方法的優(yōu)缺點對比見表2。

表2 維吉尼霉素檢測方法Table2 Analytical methods for the detection of virginiamycin

3 結 語

雖然VGM在抑制革蘭氏陽性菌生長方面有好的效果，長期被用作動物飼料添加劑，但是其引起的細菌的交叉耐藥性對人類健康的影響卻不可忽視，自從歐盟1999年禁止使用VGM作為飼料添加劑以來，各國都相繼禁止使用并且設定最高殘留限量。我國允許在限量范圍內(nèi)添加使用，但一些廠家在飼料中違規(guī)增加VGM的使用量，使得我國的動物肉制品中VGM超標的現(xiàn)象頻發(fā)，這對食品的進出口貿(mào)易是一個巨大的挑戰(zhàn)。為此，我國應該加大各類食品中VGM殘留的檢測方法研究。

就目前的前處理方法而言，過程比較復雜、不能大批量樣品處理、自動化程度低；就檢測方法而言，目前的研究焦點和大多數(shù)標準中指定的檢測方法都是LC-MS/MS，該方法精密度和靈敏度都很高，但是不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。針對上述問題，今后食品中VGM的檢測方法可以從以下方面探索：1）進一步研究ELISA法，研究不同食品的預處理方法，制備出大量的VGM特異性抗體，開發(fā)出試劑盒。2）在儀器分析方面，提高樣品預處理和樣品檢測兩個步驟的自動化程度，進一步實現(xiàn)兩個環(huán)節(jié)的在線銜接。3）探索VGM檢測的新技術。如生物芯片技術是一項集生物學、化學、計算機等學科為一體的高度交叉的新技術，具有前處理簡單、準確性高、效率非常高等優(yōu)點。此外，生物傳感技術也是具有研究潛力的新技術。4）二級檢測方法的探索。即先用ELISA法進行現(xiàn)場的初篩，對于初篩中的陽性樣品進行高度選擇性的確證。該方法結合了酶聯(lián)免疫檢測的快速、便攜、檢測量大等特點和LC-MS/MS定性定量的高靈敏度、低檢測限以及高度準確性等特點，可以降低ELISA試劑盒的開發(fā)難度，降低LC-MS/MS檢測的盲目性，從而從總體上降低檢測成本， 極大地提高了實際應用性。

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Progress in Methods for Determination of Virginiamycin Residues in Foods

LAN Yang, DONG Quan*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Virginiamycin, a cyclic peptide antibiotic, is commonly used in the disease prevention and treatment of swine, chicken and other poultry or livestocks. It can effectively increase the efficiency of feed utilization and the growth rate of animals, but antibiotic residues in foods will cause cross-resistance between bacteria, animals and humans. Certain antibiotics such as virginiamycin have bee n banned as growth promoters in the European Union since 1999. Special attention has been paid to the application of antibiotics in animals all over the world. In this article, sample pretreatment techniques and detection methods for virginiamycin residues in foods are summarized, the advantages and disadvant ages of these techniques are compared and the future development directions are propo sed. This paper will provide a reference for the detection and supervision of virginiamycin residues in foods.

antibiotic; virginiamycin; resistance; detection methods

TS201.6

A

1002-6630（2014）23-0342-05

10.7506/spkx1002-6630-201423066

2014-01-27

重慶市科技攻關項目（CSTC2009AC0008）

蘭洋（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：lyhxhds@163.com

*通信作者：董全（1962—），男，教授，博士，研究方向為現(xiàn)代食品加工理論與技術。E-mail：dongquan@swu.edu.cn