骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的調(diào)節(jié)作用

鄭貴星 李翊泉 魏小平 吳 頡 黃 俊 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，廣州510120)

骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的調(diào)節(jié)作用

鄭貴星 李翊泉 魏小平①吳 頡①黃 ?、?廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，廣州510120)

目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機制。方法:分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，采用MTT法觀察其對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力的影響，采用流式細胞儀分析骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例、細胞周期和細胞凋亡的影響。結(jié)果:B組和C組的吸光度值明顯低于A組，數(shù)據(jù)之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組吸光度值明顯低于B組，數(shù)據(jù)之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);B組和C組的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例均明顯高于A組，數(shù)據(jù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯高于B組，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);B組和C組的細胞凋亡水平明顯高于A組，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組細胞凋亡水平明顯高于B組，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細胞可以顯著抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖，其機制可能通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例，促進細胞凋亡，繼而影響T淋巴細胞的免疫功能，發(fā)揮其抑制能力。

骨髓間充質(zhì)干細胞;Ⅰ型糖尿病;大鼠;淋巴細胞

Ⅰ型糖尿病屬于特異性自身免疫病，該疾病的發(fā)生是通過一種尚不完全清楚的機制介導(dǎo)T淋巴細胞調(diào)節(jié)發(fā)生破壞胰島素β細胞的過程[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞可參與T淋巴細胞的調(diào)節(jié)，并通過多種免疫抑制介質(zhì)參與炎性反應(yīng)的控制過程[2]。此外，最新的研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞可降低糖尿病動物的血糖水平，但其具體機制尚不明確[3]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)細胞也得到了證實。因此，其之間是否存在某種聯(lián)系，值得深思。為了探討骨髓間充質(zhì)干細胞抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機制以及可能途徑，我們采取一系列的技術(shù)研究，取得一定成果，現(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 本研究采用SD大鼠，共20只，年齡2～8周齡，購買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，所需的各種培養(yǎng)基、鏈脲佐菌素、絲裂霉素以及胎牛血清等購買于美國Sigma公司，淋巴細胞分離液由上海義森生物科技有限公司提供。FACS Calibur流式細胞儀為BD公司生產(chǎn)，血糖儀購自三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司。1.2 實驗方法

1.2.1 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立 (1)選取10只體重為300g左右的SD大鼠，于標(biāo)準(zhǔn)SPF級別飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d后開始制作Ⅰ型糖尿病大鼠模型。(2)模型建立前，SD大鼠禁食6個小時，并采集鼠尾靜脈血一滴，測量SD大鼠血糖濃度，按照體重預(yù)先配制好鏈脲佐菌素溶液。(3)按每千克50 mg的標(biāo)準(zhǔn)，在SD大鼠腹腔注射10 g/L的鏈脲佐菌素，1次/d，連續(xù)注射5 d。(4)SD大鼠給予正常飲食，每周檢查一次SD大鼠的空腹靜脈血血糖水平。當(dāng)大鼠出現(xiàn)I型糖尿病相關(guān)癥狀，包括多飲多食，體重下降等癥狀，并且血糖水平連續(xù)4周超過1.4 mmol/L時確定建模成功[4]。所有實驗動物均參照美國糖尿病并發(fā)癥動物模型協(xié)會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行飼養(yǎng)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)方法 (1)選取約2周齡的健康SD大鼠，脫頸處死后于75%酒精浸泡消毒約10 min后。(2)于超凈工作臺取出股骨和脛骨，置于含有PBS的培養(yǎng)皿中，剪斷股骨和脛骨兩端，并使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。(3)將所得液體離心收集細胞，用無菌吸管反復(fù)吹打，并去除雜質(zhì)，制成細胞懸液。(4)將細胞懸液移入無菌離心管中，4℃，1 000 r/min離心 5 min，去除上清液，在離心管內(nèi)加入含有胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，混勻。(5)調(diào)整細胞濃度，接種于含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。(6)每隔3 d換液一次。當(dāng)細胞生長至約80%融合后，用相應(yīng)濃度的胰蛋白酶消化傳代，取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞用于實驗。

選取上述Ⅰ型糖尿病大鼠，脫頸處死，75%酒精消毒10 min后，無菌條件下取出脾臟，置于含有5 ml的淋巴細胞分離液的培養(yǎng)皿中，研磨充分，轉(zhuǎn)移分離液于離心管內(nèi)，加入1640培養(yǎng)基約400 μl，室溫下3 000 r/min離心30 min。并按照實驗淋巴細胞分離液操作說明書分離獲得淋巴細胞，DMEM培養(yǎng)基洗滌后，調(diào)整細胞濃度約為 1×108個/ml，備用。

1.2.3 組別設(shè)置 取生長良好的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，使用絲裂霉素C(終止細胞分裂能力)處理1 h后，棄上清，并使用DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，胰蛋白酶消化細胞，分別制成1×106和1×107兩組不同濃度的細胞懸液，然后按每孔100 μl的體積加入到24孔板中，并根據(jù)分組加入不同數(shù)量的淋巴細胞，以培養(yǎng)液補足體系。本研究根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細胞和淋巴細胞的比例分為3組，分別為A組(空白對照組，不加骨髓間充質(zhì)細胞)、B組(淋巴細胞∶骨髓間充質(zhì)干細胞=1∶0.1)和C組(淋巴細胞∶骨髓間充質(zhì)干細胞=1∶1)。每組各設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)3 d后進行實驗，共進行5次實驗。

1.2.4 檢測方法 培養(yǎng)結(jié)束前6 h，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl的5 g/L的MTT，培養(yǎng)結(jié)束后，吸取懸浮的細胞，離心，分離并重懸細胞，每孔加100 μl二甲基亞砜，震蕩溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測波長490 nm的吸光度值。以吸光度A值為縱坐標(biāo)，各組為橫坐標(biāo)，繪制淋巴細胞增殖能力柱形圖。

收集上清液至流式管中，每組使用3個流式管，離心，并用PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為107個/ ml，其中一個管加入PE anti-rat CD4和FITC anti-rat CD25，余下兩管中一管加同型對照劑，另一管作空白對照，震蕩后，4℃孵育30 min，加入PBS混勻，洗滌2次，4℃條件下，1 000 r/min離心5 min，去上清，收集底層細胞，加入500 μl PBS，懸浮細胞，進行流式細胞儀檢測，結(jié)果采用CellQuest軟件分析。

收集每組孔內(nèi)上清液于流式管中，4℃條件下，1 000 r/min離心5 min，去上清，并用 PBS重懸細胞，AnnexinV/PI雙染，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期情況，雙陽性細胞為凋亡細胞。用CellQuest軟件對檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用 CellQuest軟件對流式細胞儀檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對三組數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以絕對數(shù)和百分率表示，計量資料采用±s來表示，組間比較采用方差分析加q檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀察 本研究，大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)到5 d左右可見部分細胞呈長梭形或者三角形，呈散在分布，第三代細胞成長多呈梭形，比例約為90%生長均勻。如圖1所示。

2.2 光鏡下三組T淋巴細胞增殖情況觀察 在光

鏡下，可見B組的T淋巴細胞的增殖情況明顯低A組僅為T淋巴細胞增殖，而C組的T淋巴細胞的增殖情況明顯低于A組和B組的T淋巴細胞的增殖，表明骨髓間充質(zhì)干細胞的存在抑制了T淋巴細胞的增殖，且隨著骨髓間充質(zhì)干細胞的濃度增高，抑制程度增加，如圖2所示。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力影響 采用MTT法考察骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力影響，其中A組的吸光度值為0.64±0.055，B組的吸光度值為 0.52 ±0.044，C 組的吸光度值為 0.38 ± 0.052。B組和C組的吸光度值明顯低于A組，數(shù)據(jù)之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組吸光度值明顯低于B組，數(shù)據(jù)之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，詳細情況見表1，圖3。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro morphologicalNote:A.Primary culture of bone marrow mesenchymal stem cells in 5 days;B.The third generation culture of bone marrow mesenchymal stem cells in 3 days.

圖2 三組T淋巴細胞體系在光鏡下的增殖情況觀察Fig.2 Proliferation of T lymphocyte system in the light microscope between three groups

表1 三組細胞吸光度值比較Tab.1 Comparison of cell absorbance value between three groups

2.4 骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達比例的影響 分析三組共培養(yǎng)體系的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達比例發(fā)現(xiàn)，A組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例為6.21± 0.72，B組 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞比例為14.32±0.89，C 組 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細胞比例為23.67±1.26。B 組和C 組的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例均明顯高于A組，數(shù)據(jù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯高于B組，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳細情況見表2。

2.5 骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠細胞周期和細胞凋亡的影響 經(jīng)檢測，三組共培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)A組G0/G1期細胞比例為(97.33±1.22)%，細胞凋亡比例為(44.01±1.01)%;B組G0/G1期細胞比例為(97.45±1.32)%，細胞凋亡比例為(48.92±1.12)%;C組 G0/G1期細胞比例為(97.56 ±1.02)%，細胞凋亡比例為(58.87 ± 1.65)%。B組和C組的細胞凋亡水平明顯高于A組，數(shù)據(jù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，C組細胞凋亡水平明顯高于B組，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。三組共培養(yǎng)體系的細胞周期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳細情況見表3。

圖3 骨髓間充質(zhì)干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力的影響Fig.3 Influence of lymphocyte proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells on typeⅠdiabetic rats

表2 三組共培養(yǎng)體系的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞表達比例情況Tab.2 Expression ratio of CD4+CD25+regulatory T cells in three groups of co-culture system

表3 三組共培養(yǎng)體系的細胞周期和細胞凋亡情況Tab.3 Cell cycle and apoptosis in three groups of co-culture system

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞，具有多種功能，對骨髓中的造血干細胞具有機械支持作用，同時還能夠多向分化，參與多種組織損傷的修復(fù)[5]。此外，還可以通過特定的機制參與免疫調(diào)節(jié)。最新的研究還表明骨髓間充質(zhì)干細胞的移植可以逆轉(zhuǎn)Ⅰ型糖尿病動物的血糖水平，但其機制尚不明確[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞能夠明顯抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞的增殖。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞，參與機體的免疫調(diào)節(jié)以及機體免疫損傷的控制[6]。相關(guān)文獻報道，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的缺失或者功能異常可導(dǎo)致機體免疫平衡的喪失，甚至自身免疫疾病的發(fā)生，如Ⅰ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展均可能與機體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞功能紊亂相關(guān)[7]，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的移植可阻止動物模型Ⅰ型糖尿病的病情的進一步發(fā)展[8]。最新的研究也表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞參與免疫調(diào)節(jié)的重要效應(yīng)細胞[9]。因此，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞在調(diào)節(jié)Ⅰ型糖尿病病情發(fā)展中可能存在某種聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細胞與Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞的共培養(yǎng)體系中，淋巴細胞增殖能力受到明顯抑制，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例增高，且隨著骨髓間充質(zhì)干細胞的增多，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例升高。此外，共培養(yǎng)體系中的淋巴細胞凋亡水平升高，且隨著骨髓間充質(zhì)干細胞比例增高凋亡水平也增高。表明骨髓間充質(zhì)干細胞可能通過提高CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例促進細胞凋亡而抑制淋巴細胞的增殖。相關(guān)學(xué)者也證實，骨髓間充質(zhì)干細胞可使T淋巴細胞周期停滯在G0/G1期，進而抑制其增殖，相關(guān)研究證實，下調(diào)活化的T淋巴細胞CD25和 CD69的表達，能夠抑制 IL-2和IFN-γ 的分泌[10]。

目前，骨髓間充質(zhì)干細胞與淋巴細胞間的相互作用機制尚未完全清楚。而相關(guān)研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞還可以分泌多種細胞因子，如IL-6、IL-11、LIF、M-CSF及SCF等，并且他們也參與了骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)過程[11]，而這些細胞因子在免疫調(diào)節(jié)過程中具體扮演什么樣的角色尚不清楚，還有待進一步研究。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細胞可以顯著抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖，其機制可能通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例，促進細胞凋亡，繼而影響T淋巴細胞的免疫功能，發(fā)揮其抑制能力。

[1]黃 盛，鄭 偉，范志勇，等.不同微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細胞分化為產(chǎn)胰島素細胞的影響[J].中華實驗外科雜志，2008，25 (3):368-370.

[2]江小霞，張 毅，李秀森，等.間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30(2):130-132.

[3]東 波，張福琴，宋振順，等.骨髓間質(zhì)干細胞及其來源的產(chǎn)胰島素細胞移植對受體胰島和新生血管的影響[J].中華實驗外科雜志，2009，26(7):865-867.

[4]李煜環(huán)，宋振順，范子揚.骨髓間充質(zhì)干細胞體外對1型糖尿病大鼠淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中華實驗外科雜志，2011，28(2):209-211.

[5]Liotta F，Angeli R，Cosmi L，et al.Toll-like receptors 3 and 4 are expressed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and can inhibit their T-cell modulatory activity by impairing Notch signaling[J].Stem Cells，2008，26(1):279-289.

[6]Glennie S，Soeiro I，Dyson PJ，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells[J].Blood，2005，105(7):2821-2827.

[7]Tiritt M，Sgouroudis E D，Hennezel E，et al.Functional waning of naturally occurring CIM+regulatory T-cells contributes to the onset of autoimmune diabetes[J].Diabetes，2008，57(1):113-123.

[8]Elmani Z，Naji A，Zidi I，et al.Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25+highFOXP3+regulatory T cells[J].Stem Cells，2008，26(1): 212-222.

[9]Fontenot，Gavin，Rudensky.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(4):330-336.

[10]Nicola MD，Carlo-Stella C，Magni M，et al.Human bone marrowstromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood，2002，99(10): 3838-3843.

[11]張清軍，高 毅，潘明新，等.輸注受者骨髓間充質(zhì)干細胞對肝移植大鼠免疫功能的影響[J].中華實驗外科雜志，2007，24(12):1499-1501.

[收稿2013-11-20 修回2013-12-12]
(編輯 張曉舟)

Regulation of bone marrow mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation of typeⅠdiabetic rats

ZHENG Gui-Xing，LI Yi-Quan，WEI Xiao-Ping，WU Jie，HUANG Jun.Department of Blood Transfusion，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China

Objective:To investigate the regulation mechanisms of the bone marrow mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation of type I diabetic rats.MethodsThe rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated，cultured and identified and the effect on lymphocyte proliferation of typeⅠ diabetic rat was observed by MTT assay，and analyze the CD4+CD25+regulatory T cell ratio，cell cycle and apoptosis of type I diabetes rat by flow cytometric.ResultsB and C groups was significantly lower than the absorbance values of group A，the differences between the data were statistically significant(P ＜0.05)，C group was significantly lower than group B absorbance values，the difference was significant(P ＜0.05);the CD4+CD25+regulatory T cells of B and C groups were significantly higher than group A，the differences of the data were statistically significant(P ＜0.05)，the CD4+CD25+regulatory T cell ratio of C group significantly higher than that group B，the differences were statistically significant(P ＜0.05);the apoptosis levels of B and C groups were significantly higher than group A，the differences were statistically significant(P ＜0.05)，the apoptosis levels of C group were significantly higher in group B，the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells can significantly inhibit lymphocyte proliferation of typeⅠ diabetic rats，and it may regulate CD4+CD25+regulatory T cells，promote apoptosis，thereby affecting the immune function of T lymphocytes，and play its rejection.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Type Ⅰ diabetic;Rat;Lymphocytes

R392

A

1000-484X(2014)05-0677-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.024

①廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州510120。

②廣州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州510180。

鄭貴星(1984年－)，男，技師，主要從事免疫學(xué)方面的研究。

及指導(dǎo)教師:黃 俊(1976年－)，男，博士，副教授，主要從事病原生物學(xué)與免疫學(xué)方面的研究。