異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究*

王 芳 王玉歡 劉 斌 梁耀軍 張寶平

異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究*

王 芳①王玉歡②劉 斌③梁耀軍①?gòu)垖毱舰?/p>

目的：探討異紫堇定堿（Isocorydione）對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖的影響。方法：以100、200、400、800、1 200 μmol/L濃度的異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞體外干預(yù)，分別作用24、48、72 h后，采用MTT法檢測(cè)異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞周期的影響；結(jié)合Hoechst染色觀察處理后Siha細(xì)胞核微形態(tài)的變化；Western Blot法檢測(cè)異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞作用后凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示不同濃度的異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細(xì)胞后具有明顯的抑制其增殖的作用，呈劑量-時(shí)間依賴關(guān)系（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示400 μmol/L的異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細(xì)胞后，細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，其中G1和S期細(xì)胞比例變化不明顯，但G2期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）；Hoechst染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，400 μmol/L的異紫堇定堿作用于Siha細(xì)胞48 h后形態(tài)縮小、細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)核碎裂形成凋亡小體；Western Blot結(jié)果顯示400 μmol/L的異紫堇定堿分別作用于人宮頸癌Siha細(xì)胞24、48、72 h后，其Bax蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax/Bcl-2比值增加，Caspase-3蛋白表達(dá)逐漸增多。結(jié)論：異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，其促使細(xì)胞發(fā)生凋亡行為可能與線粒體凋亡途徑的蛋白有關(guān)。

異紫堇定堿 人宮頸癌Siha細(xì)胞 生長(zhǎng)抑制 凋亡

異紫堇定堿是從罌粟科禿瘡花屬植物禿瘡花（Dicranostigma Leptopodum（Maxim.）Fedde，DLF）又名紅茂草（Herba dieranostigmae）中分離得到的一種異喹啉類生物堿單體，已有研究證實(shí)，其藥理活性成分具有抗腫瘤、抑菌、抗溶血、清除自由基、改善微循環(huán)以及提高機(jī)體免疫力等作用［1-5］。HPV是人類感染的主要病毒之一，研究證實(shí)宮頸癌的發(fā)生與HPV感染密切相關(guān)，尤其高危型HPV16，18兩個(gè)亞型。以往傳統(tǒng)的治療手段對(duì)于HPV感染宮頸癌患者存在一定缺陷性，因此，在研究宮頸癌臨床治療過(guò)程中，尋找特異性的抗HPV藥物具有至關(guān)重要的意義。且目前有關(guān)異紫堇定堿對(duì)感染不同亞型HPV的宮頸癌抑制作用方面的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將探討異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha HPV16（+）細(xì)胞增殖的影響，以尋求新型的抗HPV感染的宮頸癌臨床治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 異紫堇定堿單體由中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理所柳軍璽研究員惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國(guó)Gibico公司），96孔培養(yǎng)板（Nunc）；新生胎牛血清（購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司）；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑PI（購(gòu)自Invitrogen公司）；RIPA裂解液（Beyotime）；Western Blot一抗Bcl-2（1：500），Bax（1：500）（購(gòu)自Bioworld公司，Caspase-3 CST公司）（1：1 000），山羊抗小鼠以及山羊抗兔二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備 Heal Force-Mini型超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo，MC0-18AIC（UV）），倒置熒光顯微鏡Olymous X-81，流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur Cell Sorting System），酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀（Bio-Rad Model 680），Western Blot實(shí)驗(yàn)儀器全為Bio-Rad公司Mini型電泳轉(zhuǎn)印儀器。

1.1.3 細(xì)胞株 人宮頸癌Siha細(xì)胞HPV16（+）（Cat：TCHu113）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Siha細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清+RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37℃、95%飽和濕度的恒溫密閉孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，細(xì)胞貼壁80%～90%時(shí)傳代，約2～3d傳代1次。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡分別對(duì)傳2～3代的人宮頸癌Siha細(xì)胞以及經(jīng)不同濃度的異紫堇定堿處理不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)判定細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式、細(xì)胞折光率以及貼壁率等一系列形態(tài)學(xué)改變特征判定其產(chǎn)生的直觀影響。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌Siha細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔總體系為200 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為100、200、400、800、1 200 μmol/L用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的異紫堇定堿。每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，用1640培養(yǎng)液200 μL設(shè)為調(diào)零點(diǎn)，加入不含異紫堇定堿的細(xì)胞培養(yǎng)液（細(xì)胞液、培養(yǎng)液各為100 μL）為空白對(duì)照組，將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，換無(wú)血清培養(yǎng)液，并加入MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL/孔，振蕩10 min，置Bio-Rad Model 680酶標(biāo)儀操作界面下選擇波長(zhǎng)490 nm測(cè)定吸光值（A值），計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，按公式細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A×100%），計(jì)算細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 PI染色標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Siha細(xì)胞周期變化 收集經(jīng)異紫堇定堿作用后的人宮頸癌Siha細(xì)胞，按照Invitrogen流式細(xì)胞試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行樣品準(zhǔn)備，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由流式細(xì)胞儀給出，并分析各組細(xì)胞周期變化。

1.2.5 Hoechst 33342染色觀察Siha細(xì)胞凋亡微形態(tài)改變 應(yīng)用Hoechst 33342熒光染料對(duì)異紫堇定堿作用后的人宮頸癌Siha細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察。將2.5× 106密度細(xì)胞接種入24孔板內(nèi)進(jìn)行爬片，培養(yǎng)24 h后，刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸出培養(yǎng)基，加入0.5 mL固定液，4℃過(guò)夜固定，棄固定液，PBS清洗3次，每次搖床搖蕩5 min，再加入0.5 mL Hoechst 33342染色液，染色5 min，棄染色液，PBS清洗3次，每次5 min，吸盡液體，滴加抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右的熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核微形態(tài)變化。

1.2.6 Western Blot法檢測(cè)Siha細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取人宮頸癌Siha細(xì)胞總蛋白，蛋白定量采用BCA法，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值，計(jì)算樣品中的蛋白含量。60 μg的總蛋白樣品被置于100℃沸水煮7 min進(jìn)行變性。蛋白電泳用80V跑凝縮膠，100V跑分離膠，轉(zhuǎn)膜采用200mA恒流1～2 h；或者100V電壓，冰水浴1 h，具體根據(jù)蛋白分子量的大小決定。轉(zhuǎn)完膜后用TBST清洗1次，加入5%脫脂奶粉封閉緩沖溶液，輕輕搖動(dòng)2 h。棄掉5%封閉緩沖溶液，分別孵育Bax（1：500）、Bcl-2（1：500）、Caspase-3（1：1 000）一抗，4℃過(guò)夜。從抗體中取出PVDF膜，用TBST清洗3次，每次搖床搖動(dòng)10 min，TBS洗2次，每次10 min；將膜放入適量的二抗中。室溫輕輕搖動(dòng)2 h，再用TBST液清洗3次，每次10 min，TBS洗2次，每次10 min。取出膜并輕輕吸取多余水分，按一定的比例加入化學(xué)發(fā)光液，用ChemiDocTMXRS+System with Image LabTMSoftware成像，蛋白條帶判定由預(yù)染分子量的Marker提供參考。Western Blot結(jié)果用Image-pro plus 6.0軟件分析各條帶的IOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，結(jié)果采用±s表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)異紫堇定堿干預(yù)分別作用24、48、72 h后，肉眼均可見有細(xì)胞脫落，部分懸浮在培養(yǎng)液中。光鏡下見細(xì)胞變圓，體積縮小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多顆粒，顏色加深，呈深褐色，核顏色也加深，折光性增強(qiáng)；而對(duì)照組細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，幾乎無(wú)脫落，光鏡下見細(xì)胞長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)飽滿，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片（圖1）。

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察Siha細(xì)胞形態(tài)變化（×200）Figure 1 Changes in the morphology of SiHa cells by optical microscopy

2.2 異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖抑制作用

異紫堇定堿以時(shí)間劑量依賴方式抑制細(xì)胞的增殖，濃度100、200、400、800、1 200 μmol/L的異紫堇定堿對(duì)細(xì)胞均有明顯的抑制作用，其中24 h抑制率分別為：0、2.13%、10.3%、39.7%、44.5%；48 h抑制率則為：8.6%、11.9%、21.3%、54.1%、60.4%；72 h抑制率為：14.8%、28.9%、47.5%、69.7%、76.4%；且隨著培養(yǎng)液中異紫堇定堿濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間與濃度依賴性；此外，細(xì)胞的存活能力與異紫堇定堿的濃度也存在依賴關(guān)系。與對(duì)照組相比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)之間具有顯著性差異（P＜0.05），不同濃度之間也存在顯著性差異（P＜0.05，圖2）。

圖2 MTT檢測(cè)異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖抑制作用Figure 2 MTT assay shows the inhibitory action of SiHa human cervical carcinoma cells[HPV(+)]and CHO cells[HPV(-)]after treatment with isocorydine

2.3 PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變

異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞周期的影響不同濃度的異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細(xì)胞24，48，72 h后，細(xì)胞周期發(fā)生率明顯改變，其中G1期和S期細(xì)胞比例未見明顯變化，而以G2期細(xì)胞減少最為顯著，且隨著異紫堇定堿濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G2期細(xì)胞減少率也明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。這說(shuō)明異紫堇定堿誘導(dǎo)人宮頸癌Siha細(xì)胞具有明顯的周期依賴性，在同一時(shí)間段，隨藥物濃度的增加細(xì)胞周期改變明顯，二者呈正相關(guān)（P＜0.01）。同一濃度不同時(shí)間段（24，48，72 h）細(xì)胞的G2期減少的幅度率逐漸增強(qiáng)（圖3）。

圖3 異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞周期的干預(yù)作用Figure 3 Changes in the cell cycle of SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione intervention

2.4 Heochst 33342染色觀察細(xì)胞核微形態(tài)的變化

Hoechst染色結(jié)果顯示：未干預(yù)的Siha細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色均一，藍(lán)染較淡；經(jīng)400 μmol/L Isocorydione的處理48 h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞形態(tài)縮小、不規(guī)則，細(xì)胞核固縮或碎裂為小核，形成凋亡小體（圖4）。

圖4 異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞微形態(tài)的影響（×400）Figure 4 Micromorphologic effects of SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione treatment

2.5 Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)

以400 μmol/L的異紫堇定堿作用24，48，72 h Siha細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均增加，Bcl-2蛋白表達(dá)則減少，而Bax/Bcl-2的比值增加（圖5）。

圖5 異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in SiHa human cervical carcinoma cell lines after isocorydione intervention

3 討論

宮頸癌的發(fā)病與HPV感染密切相關(guān)［1-2，6-11］，研究表明，70%的宮頸癌是由HPV16和HPV18引起［12-13］。而HPV16、HPV18及其亞型，也被稱為宮頸癌發(fā)生的高危亞型。但目前臨床仍然沒(méi)有針對(duì)HPV陽(yáng)性宮頸癌治療有效的靶向藥物，由于傳統(tǒng)中草藥物所具有抗HPV感染及抗腫瘤的藥理活性［14-15］，這為宮頸癌臨床藥物治療提供了一種可供選擇的途徑。有諸多研究報(bào)道［1，3-5］，異紫堇定堿具有抗肝癌、抑菌、抗溶血、清除自由基、改善心肌微循環(huán)以及提高荷瘤小鼠免疫力等作用，鑒于異紫堇定堿上述的藥理活性作用以及在抗HPV感染及人宮頸癌作用機(jī)理等方面研究報(bào)道的不明確。

本實(shí)驗(yàn)采用HPV16陽(yáng)性人宮頸癌Siha細(xì)胞，探討異紫堇定堿對(duì)人宮頸癌Siha細(xì)胞增殖的作用。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示異紫堇定堿能使人宮頸癌Siha細(xì)胞變圓，體積縮小，部分脫落，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多顆粒，顏色加深，呈深褐色，核顏色也加深；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：異紫堇定堿對(duì)人宮頸Siha細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細(xì)胞后，細(xì)胞周期發(fā)生率明顯改變，其中G2期細(xì)胞比例明顯減少，且隨著異紫堇定堿濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞比例也明顯減少；Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示：異紫堇定堿作用人宮頸癌Siha細(xì)胞24，48，72 h，Bax蛋白表達(dá)增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax/Bcl-2的比值增加，Caspase-3蛋白表達(dá)增加；且隨著時(shí)間和藥物劑量的增加，Bax蛋白也表達(dá)增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax/Bcl-2的比值增加，Caspase-3蛋白表達(dá)增加。Yazan等［16］研究發(fā)現(xiàn)，從茴香花里提取的百里醌通過(guò)下調(diào)Bcl-2基因凋亡使得Siha細(xì)胞發(fā)生凋亡。Kniazhanski等［17］研究顯示，茉莉酸甲酯通過(guò)多途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞死亡。Xu等［18］發(fā)現(xiàn)，血根堿能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa和Siha的細(xì)胞的凋亡，引起B(yǎng)cl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)增加，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。上述文獻(xiàn)的報(bào)道與本研究結(jié)果相類似。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異紫堇定堿作用于人宮頸癌Siha細(xì)胞后，可使Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而與其相反的Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；隨著時(shí)間和藥物劑量的增加，Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值增加，而凋亡指數(shù)升高，凋亡執(zhí)行者Caspase-3表達(dá)增加。這表明Bax/Bcl-2參與介導(dǎo)人宮頸癌Siha細(xì)胞的凋亡；并且還可以通過(guò)激活下游的Caspase-3，引起一系列的酶聯(lián)激活反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，本研究可初步推斷異紫堇定堿促使HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌Siha細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程可能與線粒體途徑的凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)，而本研究對(duì)于其他諸如死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的凋亡途徑未涉及，考慮到臨床中目前依然沒(méi)有特別有效地針對(duì)感染不同亞型HPV的靶向抗腫瘤藥物，后期可以隨著研究的深入將異紫堇定堿研發(fā)為新型具有靶向特性的抗HPV感染的抗腫瘤臨床藥物。

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（2013-06-12收稿）

（2013-09-18修回）（本文編輯：賈樹明）

Effects of isocorydione on cell proliferation in SiHa human cervical carcinoma cell lines

Fang WANG1,Yuhuan WANG2,Bin LIU3,Yaojun LIANG1,Baoping ZHANG4

Bin LIU;E-mail:2638541021@qq.com
1The Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2Graduate School of Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;3Lanzhou University College of Stomatology and4Biomechanics Institute of the School of Civil Engineering and Mechanics,Lanzhou 730000,China

Objective:This paper aimed to investigate the effects of isocorydinone on cell proliferation in SiHa human cervical carcinoma cell lines.Methods:Different concentrations of isocorydione(100,200,400,800,and 1200μmol/L)were used to treat SiHa human cervical carcinoma cells in vitro for 24,48,and 72 h.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assays were conducted to determine the inhibitory action of isocorydione.Flow cytometry was performed to detect the cell cycle in SiHa human cervical carcinoma cells after treatment with 400μmol/L isocorydione.Hoechst 33342 staining was used to observe the micro-morphological changes of SiHa cell nucleus after the treatment.The expression of Bcl-2,Bax,and caspase-3 proteins in cervical carcinoma SiHa cell lines was determined using western blot analysis.Results:MTT assays showed that isocorydione inhibits the proliferation of SiHa cells in a dose-and time-dependent manner(P<0.05).The flow cytometry results showed that SiHa cervical carcinoma cells treated with different concentrations of isocorydione exhibited increased cell cycle.Compared with the control group,Hoechst 33342 staining showed that SiHa cells became narrow,with nuclear pyknosis and fragmentation,and formed an apoptotic body after treatment with 400μmol/L isocorydione for 48 h.Furthermore,western blot analysis proved that isocorydione significantly inhibited the proliferation of SiHa cell lines, and the expression of Bax protein was increased.By contrast,the expression of Bcl-2 protein decreased gradually.Consequently,the ratio of Bax/Bcl-2 increased,as well as the expression of caspase-3 protein.Conclusion:Isocorydione exhibited an overt inhibitory ac-tion on SiHa cells.Isocorydione promoted the occurrence of cell apoptosis,which may be associated with related proteins of mitochondrial apoptotic pathway.

isocorydione,human cervical carcinoma SiHa cell line,growth inhibition,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20130928

①蘭州大學(xué)第二醫(yī)院（蘭州市730000）；②甘肅省中醫(yī)學(xué)院研究生院；③蘭州大學(xué)；④蘭州大學(xué)生物力學(xué)所

*本文課題受國(guó)家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃973項(xiàng)目基金（編號(hào)：2010CB834202）、國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：30770639）、甘肅省自然科學(xué)基金（編號(hào)：0702NKDA045，0801NKDA001）和甘肅省科技支撐項(xiàng)目（編號(hào)：090NKCA125）資助

劉斌 2638541021@qq.com

This study was supported by the State Key Basic Research Development Program of China(973 Program;No.2010CB834202), National Natural Science Foundation of China(Key program)(No.30770639),Natural Science Foundation of Gansu Province (No.0702N KDA045;No.0801NKDA001),and Scientific and Technologic Support Program of Gansu Province(No.090NKCA125)

王芳 醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師。研究方向?yàn)閶D科腫瘤臨床治療、宮頸癌早期篩查、抗宮頸癌藥物篩選及生殖內(nèi)分泌的相關(guān)基礎(chǔ)研究。

E-mail：wangfang@lzu.edu.cn