氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定南極磷蝦油中的EPA和DHA含量

汪勝福，劉建君，門敬菊，郭忠，馮迪娜，朱曉麗，張慶香

（1.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司技術(shù)中心，遼寧大連116113；2.中國人民解放軍第210醫(yī)院臨床藥理基地，遼寧大連116011）

南極磷蝦（Antarctic krill）學(xué)名Euphausia superba，屬于動(dòng)物界節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼亞門軟甲綱、磷蝦目、磷蝦科。分布區(qū)域在南極磷蝦棲息在南極輻合區(qū)以南的南極海域里。南極磷蝦富含蛋白質(zhì)、磷脂、蝦青素、甲殼素、酶等營養(yǎng)成分與活性成分；南極磷蝦中的脂類相比于蛋白質(zhì)來說含量較少，但磷蝦脂類中，以極性脂含量最高，甘油三酯次之，分別為總脂肪的56 %～81%和12%～38%。南極磷蝦脂類所含的脂肪酸種類多，且多為不飽和脂肪酸，尤其EPA 和DHA 含量較高[1]。EPA 和DHA 是根據(jù)它們化學(xué)結(jié)構(gòu)含碳的多少，也叫二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。EPA 和DHA 是組成磷脂、膽固醇酯的重要脂肪酸。EPA、DHA 的體內(nèi)來源是α-亞麻酸。α-亞麻酸進(jìn)入人體后，在同一種去飽和酶的作用下，在人體中衍生為EPA 和DHA，α-亞麻酸和EPA 與DHA 均屬于Omega-3 脂肪酸[2]。許多科學(xué)家研究證明：Omega-3 有益于預(yù)防和治療冠心病、糖尿病、類風(fēng)濕、皮炎、癌癥、抑郁癥、神經(jīng)分裂癥、癡呆、過敏、哮喘、腎病和慢性阻塞性肺病等[3-4]。故而，南極磷蝦近年來引起國內(nèi)外廣泛重視。隨著消費(fèi)者需求量不斷增加，大規(guī)模提取工藝不斷優(yōu)化，其中有效成分EPA、DHA 含量存在較大差異，因此，建立南極磷蝦油產(chǎn)品中EPA 與DHA 的快速客觀準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)于當(dāng)前南極磷蝦研究與質(zhì)量控制均具有極其重要的意義。另一方面，油脂中脂肪酸的測(cè)定通常需要甲酯化處理，常用的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫（TMSH）法、甲醇鉀法、重氮甲烷、鹽酸/甲醇、硫酸/甲醇和氫氧化四甲胺/甲醇等[5]。本研究通過KOH-甲醇、硫酸-甲醇的回流甲酯化方法，與GB 28404-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品中α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)上的甲酯化方法[7]，進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè)南極磷蝦油制品中的EPA 與DHA 的含量對(duì)比，優(yōu)選出具有操作簡單、快捷、客觀準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 試樣及試劑

南極磷蝦油：遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司；EPA/DHA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國SIGMA 公司；異辛烷、正己烷、甲醇均為色譜純；氫氧化鉀、濃硫酸為分析純；2 mol/L KOH-甲醇溶液、2 mol/L 硫酸-甲醇溶液：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

7820A 型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測(cè)器）：美國Agilent 公司；AL204 型電子天平（0.1 mg）：梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-88 型石英毛細(xì)管柱，100 m×0.250 mm×0.20 μm；色譜柱溫度：210 ℃恒溫20 min，以3 ℃/min 升溫至240 ℃，維持20 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；FID 檢測(cè)器溫度：260 ℃；進(jìn)樣方式：分流，分流比10 ∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：高純氮?dú)猓?9.99%）。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

DHA 甲酯、EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)液：均用正己烷配制成濃度為0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.100 mg/mL、0.200 mg/mL、0.400 mg/mL、0.800 mg/mL、1.000 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用時(shí)配制。

1.4.2 樣品制備[5]

堿酸法：稱樣0.5 g 左右到錐形瓶中，加10 mL KOH-甲醇溶液，100℃下冷凝回流5min，放涼。加10mL硫酸甲醇溶液，100 ℃下冷凝回流5 min，放涼至30 ℃～40 ℃。加5 mL 異辛烷，保持30 ℃～40 ℃振搖30 s 提取。立即加入25 mL 飽和氯化鈉溶液充分振搖，放涼至室溫，靜置分層，吸取有機(jī)相于10 mL 離心管中，經(jīng)3 000 r/min 離心5 min，進(jìn)樣。

GB28404 法[7]：稱取混合均勻的油類制品0.2 g～1 g至25 mL 容量瓶中，加入5 mL 正己烷輕搖溶解，并用正己烷定容至刻度，搖勻。吸取上述溶液3.0mL 至10mL至具塞刻度試管中，加入3.0 mL 氫氧化鉀甲醇溶液，立即移至渦旋混合器上振蕩混合5 min，靜置5 min，加入6 mL 蒸餾水，上下振搖0.5 min，靜置分層后，吸取下層液體，棄去后再反復(fù)用少量蒸餾水進(jìn)行洗滌，并用吸管棄去水層，直至洗至中性（若有機(jī)相有乳化現(xiàn)象，以4 000r/min 離心10min），吸取正己烷層待上機(jī)測(cè)試用。

1.4.3 結(jié)果計(jì)算

對(duì)所得的色譜圖，以外標(biāo)法、歸一化法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算：

式中：Xi 為試樣中EPA、DHA 的含量，（mg/g）；Ci為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得測(cè)定樣液中各脂肪酸甲酯的濃度，（mg/mL）；V 為被測(cè)定樣液的最終定容體積，mL；m 為試樣的稱樣質(zhì)量，g；F 為各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)，EPA 甲酯轉(zhuǎn)化為EPA 脂肪酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.955 7；DHA 甲酯轉(zhuǎn)化為DHA 脂肪酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.959 0；

歸一化法：由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號(hào)，得到相應(yīng)的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計(jì)算各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 EPA 甲酯和DHA 甲酯的色譜分離

利用優(yōu)化好的氣相色譜分離條件，首先對(duì)EPA/DHA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分離，其色譜圖見圖1a。

由圖1a 可見，EPA 甲酯、DHA 甲酯的保留時(shí)間分別為27.683 min、35.878 min，二種脂肪酸甲酯分離良好。

對(duì)南極磷蝦油樣品進(jìn)行分離，其圖譜見圖1b。從圖1b 可以看出，EPA，DHA 兩個(gè)組分得到分離，并且其余組分不干擾測(cè)定。

圖1 EPA 甲酯、DHA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（a）與南極磷蝦油樣品（b）的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograph of EPA ester，DHA ester standards（a）and a sample of antarctic krill oil（b）

2.2 外標(biāo)法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

對(duì)不同濃度的EPA 甲酯、DHA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行色譜分析，并以得到的色譜峰面積對(duì)濃度作圖，可以得到兩者的曲線方程如表1，可以看出兩者都滿足要求（R2＞0.995）。

表1 EPA 甲酯、DHA 甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與相關(guān)系數(shù)Table 1 EPA methyl ester DHA standard curve and the correlation coefficients

2.3 EPA 和DHA 的回收率

在100 mg 的南極磷蝦油樣品中分別精確加入一定量的EPA 和DHA，按2.4.2（堿酸法）所述步驟測(cè)定，2.4.3 定量分析，進(jìn)樣次數(shù)為5 次，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.4 外標(biāo)法和峰面積歸一化法對(duì)結(jié)果影響

取同一南極磷蝦油樣品（20121101YA004-5P 批）5 份，按2.4.2（堿酸法）所述步驟測(cè)定，2.4.3 定量分析，得EPA 和DHA 的精密度，結(jié)果見表3、表4；對(duì)情況來看，外標(biāo)法測(cè)得數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小、重現(xiàn)性好，對(duì)南極磷蝦油的提取工藝優(yōu)化與檢測(cè)更具有意義，見表5。

表2 EPA 和DHA 的加標(biāo)回收率及其精密度（n=3）Table 2 Recoveries and precisions（RSDs）of EPA and DHA spiked in Samples（n=3）

表3 南極磷蝦油樣品中EPA 和DHA 的分析精密度（外標(biāo)法n=6）Table 3 The precisions of EPA and DHA in antarctic krill oil（External Standard Method n=6）

表4 南極磷蝦油樣品中EPA 和DHA 的分析精密度（歸一化法）Table 4 The precisions of EPA and DHA in antarctic krill oil（Normalization Method n=6）

表5 外標(biāo)法和峰面積歸一化法的結(jié)果對(duì)比Table 5 The comparison results of external standard method and peak area normalization method

2.5 對(duì)比GB 28404-2012 法測(cè)定

取同一南極磷蝦油樣品（20121101YA004-5P 批）5 份，按2.4.2（GB28404 法）所述步驟測(cè)定，按照2.4.3所述步驟定量分析，得EPA 和DHA 的結(jié)果，見表6。

表6 國標(biāo)法測(cè)得南極磷蝦油中EPA、DHA 含量的結(jié)果Table 6 The content results of EPA and DHA in antarctic krill oil by national standard（GB 28404）

通過甲酯化方法的對(duì)比，堿酸法進(jìn)行甲酯化比較完全，而GB 28404 法甲酯化程度不夠完全，致使外標(biāo)法EPA、DHA 含量測(cè)定比較低，偏低幅度分別為EPA：6.6%，DHA：11.4%，而歸一化法測(cè)得數(shù)據(jù)基本在10%的誤差范圍內(nèi)；歸一化法由于受樣品本身固有物質(zhì)屬性與甲酯化處理方法甲酯化率的制約，稱取的樣品中含有一定量的未甲酯化的成分，以及色譜柱分離條件的限制，致使有一些峰達(dá)不到理想的分離效果，峰面積積分存在難以避免的偏差，這些因素致使測(cè)定的EPA、DHA 含量不夠客觀準(zhǔn)確。而外標(biāo)法是氣相色譜當(dāng)中一種比較理想的定量方法，它要求標(biāo)準(zhǔn)品純度達(dá)到要求，對(duì)操作條件要求不高，被公認(rèn)為是測(cè)定脂肪酸含量的方便、準(zhǔn)確的定量方法之一。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采取堿酸法對(duì)脂肪酸進(jìn)行回流甲酯化，甲酯化程度高，用外標(biāo)法測(cè)定EPA、DHA 含量，此方法操作簡便快速，易消除干擾，避免了其他方法對(duì)EPA、DHA 不飽和脂肪酸成分進(jìn)行測(cè)定時(shí)采取所有甲酯化脂肪酸達(dá)到分離度的不必要麻煩，該方法在準(zhǔn)確性、線性、重現(xiàn)性、回收率等方面均達(dá)到滿意結(jié)果。

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