玉米漿干粉緩沖能力對發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的影響

魯敏，呂璇，關(guān)曉輝

（東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林吉林132012）

細菌纖維素（Bacterial cellulose，簡寫為BC）是由D-葡萄糖以β-1，4 糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖高分子，具有（C6H10O5）n 的組成[1]。BC 與自然界中存在的植物纖維素相比，具有超純、超細、超強、持水能力強等許多獨特的性質(zhì)[2-4]。近幾十年隨著分子生物學(xué)的進步和人們對BC 本質(zhì)和合成機理的認識，生物合成纖維素在食品、醫(yī)藥、化工和精紡等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛應(yīng)用前景，是當今生物材料研究的熱點之一[5-8]。但由于BC 的產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高，難以實現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用。而解決BC 產(chǎn)量低的關(guān)鍵措施就是選育優(yōu)質(zhì)的菌種和優(yōu)化培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件（如pH、溫度、溶解氧、種齡、接種量和發(fā)酵周期等）。

本課題組從醋醅中篩選并馴化出一株高效生產(chǎn)BC 的菌種——木葡糖酸醋桿菌Gyll（Gluconacetobacter xylinus）。同時以玉米漿干粉為氮源對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化研究[9]。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，pH 是影響木葡糖酸醋桿菌合成細菌纖維素的重要參數(shù)。因為發(fā)酵合成過程中，菌種需要將發(fā)酵液中的葡萄糖或蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸，同時還會生成其它一些酸性物質(zhì)，致使發(fā)酵液的pH 下降，從而導(dǎo)致纖維素產(chǎn)量下降。所以，提高BC 產(chǎn)量的有效手段之一是利用建立緩沖體系來保持發(fā)酵過程中pH 基本恒定。曾有報道，在靜態(tài)培養(yǎng)過程中加入醋酸可有效地提高BC 的產(chǎn)量[10]。但是，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，緩沖溶液的加入勢必會提高BC 的生產(chǎn)成本。試驗研究發(fā)現(xiàn)，適量加入玉米漿干粉可以提高發(fā)酵培養(yǎng)基的緩沖能力，有效減緩pH 變化，使得BC 的產(chǎn)量高于其它培養(yǎng)基[11]。為此，本文通過加入酸或堿，對玉米漿干粉的緩沖能力及維持發(fā)酵過程pH穩(wěn)定的能力進行了試驗研究，并對發(fā)酵過程中的pH和BC 產(chǎn)量進行了監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus Gyll），由本實驗室分離獲得。

種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖2；蛋白胨0.5；酵母膏0.5；檸檬酸0.1；Na2HPO4·12H2O 0.2；KH2PO40.1；MgSO4·7H2O 0.025；pH 5.8，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：葡萄糖5；玉米漿干粉5；檸檬酸0.1；Na2HPO4·12H2O 0.2；KH2PO40.1；MgSO4·7H2O 0.025；乙醇0.5；pH6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器

YXQ.SG41.280 型高壓蒸汽消毒器：上海醫(yī)用核子儀器廠；Taisite 凈化工作臺：天津泰斯特儀器有限公司；AL204 精密電子天平：上海青浦滬西儀器廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；HZQX100 恒溫振蕩器：北京佳源興業(yè)科技有限公司。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)法

1.3.1 靜態(tài)培養(yǎng)

取已活化的菌株接入種子培養(yǎng)基，在28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min 的條件下，振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的種子接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中（盛裝在培養(yǎng)皿中），接種時需充分振蕩，使菌株分離出來并充分分散在發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)一定時間。

1.3.2 動態(tài)培養(yǎng)

取已活化好的菌株接入種子培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。再取出培養(yǎng)好的種子接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中（盛裝在錐形瓶中），接種時需充分振蕩，使菌株分離出來并充分分散在發(fā)酵培養(yǎng)基中。將盛有發(fā)酵培養(yǎng)液的錐形瓶放置于搖床平臺上，設(shè)定搖床腔內(nèi)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，發(fā)酵一定時間。

1.4 菌種總數(shù)測定

在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，采用稀釋倍數(shù)法測定培養(yǎng)液中菌體的濃度[12]。

1.5 殘?zhí)呛繙y定

用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定培養(yǎng)基中可溶性還原糖含量[13]。

1.6 產(chǎn)物分離與提純

取出BC 膜，蒸餾水多次沖洗除去膜表面雜質(zhì)。再將膜浸入0.1 mol/L 的NaOH 溶液煮沸30 min，除去殘存的菌體蛋白和培養(yǎng)基。用去離子水反復(fù)沖洗，0.5%乙酸浸泡過夜。然后用去離子水沖洗，至pH 試紙測其表面為中性，此時膜呈乳白色半透明狀，105 ℃干燥至恒重。纖維素產(chǎn)量表示為：g 纖維素干重/1 L 培養(yǎng)液。

1.7 玉米漿干粉的緩沖能力測定

每次向500 mL 玉米漿干粉溶液中加入3 mL 0.2 mol/LNaOH 或0.2mol/LH2SO4溶液后測定pH。緩沖指數(shù)（β）的物理意義是相關(guān)酸堿組分分布線的斜率[14]。

式中：Δ[OH]為0.2 mol/L NaOH 或0.2 mol/L H2SO4加入后摩爾濃度的變化；ΔpH 為pH 的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)方式的確定

不同培養(yǎng)方式對細菌纖維素生產(chǎn)的影響見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)方式生產(chǎn)的細菌纖維素Fig.1 BC in the different fermentation system

由圖1（a）可知，篩選出的菌種經(jīng)過一段時間的靜態(tài)培養(yǎng)后，在發(fā)酵液表面（氣-液交界面）產(chǎn)生乳白色半透明、外表均勻光滑、質(zhì)地柔韌的凝膠化膜；當該膜達到一定厚度時，在重力的作用下會下沉至發(fā)酵液底部，而在發(fā)酵液表面又會形成新的凝膠膜。而采用動態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素時[圖1（b）]，將錐形瓶在生化振蕩培養(yǎng)箱中以一定轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)，由于搖動過程中產(chǎn)生剪切力不會形成片狀膜，而是完全分散在發(fā)酵液中，呈不規(guī)則的絲狀、星狀或微團狀。

實驗過程中采用三級培養(yǎng)方式：1）一級種子振蕩培養(yǎng)：取1 環(huán)活化好的斜面種子接入150 mL 種子培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，接種時充分振蕩，以釋放出菌體（振蕩器轉(zhuǎn)速為120 r/min）。2）二級種子擴大化培養(yǎng)：取振蕩培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基，以10%接種量接入相同體積的新種子培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)20 h。3）靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：取二級種子以10%接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28 ℃靜置培養(yǎng)8 d。

2.2 玉米漿中部分物質(zhì)的含量測定

玉米漿干粉是以鮮玉米漿經(jīng)低溫、瞬間加熱噴霧干燥而成的產(chǎn)品，其主要成分是氨基酸、多肽類，并含有豐富的維生素、生長因子等，可作為生化制藥、生物發(fā)酵等領(lǐng)域重要的營養(yǎng)添加源。經(jīng)實驗測定，玉米漿干粉中蛋白質(zhì)、乳酸和還原糖的質(zhì)量百分含量分別為43.34%、17.57%和7.89%。由此說明，玉米漿干粉中豐富的蛋白質(zhì)可為細菌纖維素的制備提供氮源，同時少量還原糖和乳酸可以提供部分碳源和有機酸，既可降低培養(yǎng)基成本，又能提高纖維素的產(chǎn)量。

2.3 玉米漿干粉添加量的確定

以玉米漿干粉為有機氮源替代蛋白胨和酵母膏，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液作對照，考察其用量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 玉米漿干粉添加量對纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of additional amount of dried corn steep liquor powder on cellulose production

由圖2 可知，Gluconacetobacter xylinus Gyll 能夠利用玉米漿干粉作為氮源生產(chǎn)細菌纖維素；隨著玉米漿干粉添加量的提高，體系營養(yǎng)增加，有利于菌體生長繁殖，使得發(fā)酵液中菌體濃度增加，從而提高細菌纖維素的產(chǎn)量；但當加入的玉米漿干粉過多時，菌體初期生長過于旺盛導(dǎo)致對碳源需求量增加，而體系不能滿足其需要使得BC 產(chǎn)量下降，因此后續(xù)試驗中確定玉米漿干粉的添加量為50 g/L。

2.4 純玉米漿干粉溶液緩沖能力測定

圖3 為不同濃度純玉米漿干粉溶液，在pH 為4.0～7.0 范圍內(nèi)，緩沖指數(shù)β 值的變化情況。

由圖3 可知，在所測定的pH 變化范圍內(nèi)，隨著玉米漿干粉濃度的增大，溶液的緩沖能力增強；且隨著pH 的增大，玉米漿干粉溶液的緩沖能力有所下降。當玉米漿干粉添加量＜50.0 g/L 時，溶液的β 值趨于平穩(wěn)變化且小于0.02，表明該兩種溶液具有弱的緩沖容量；而當玉米漿干粉添加量≥50.0 g/L 時，溶液的β 值均大于0.02，說明該溶液具有很強的緩沖能力。

圖3 不同濃度玉米漿干粉水溶液β 值變化Fig.3 Changes in the β-value of different concen-tration of dried corn steep liquor powder solution

2.5 玉米漿干粉發(fā)酵培養(yǎng)基緩沖能力測定

圖4 是以不同濃度玉米漿干粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，在pH 值為4.0～7.0 范圍內(nèi)的β 值變化情況。

圖4 不同濃度玉米漿干粉發(fā)酵培養(yǎng)基β 值變化Fig.4 Changes in the β-value of different concen-tration of dried corn steep liquor powder medium

由圖4 可知，不同濃度玉米漿干粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基的β 值變化趨勢同圖3；不同的是當玉米漿干粉溶液中添加其他物質(zhì)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基后，發(fā)酵培養(yǎng)基的β 值均有不同程度的提高；玉米漿干粉添加量≥40.0 g/L 時，發(fā)酵培養(yǎng)基的β 值均大于0.02，說明玉米漿干粉添加量≥40.0 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，在菌株培養(yǎng)過程中將具有很強的緩沖能力。分析原因可能是由于玉米漿干粉中自身存在的、或加入的及生成的弱酸及其共軛堿（如磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬酸–檸檬酸鈉、乙酸–乙酸鈉、磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀等），對發(fā)酵培養(yǎng)基的緩沖能力的提高有所貢獻。

2.6 發(fā)酵過程中pH 和BC 產(chǎn)量監(jiān)測

分別以不同含量玉米漿干粉（30.0、40.0 g/L 和50.0 g/L）和蛋白質(zhì)（50.0 g/L）+酵母膏（50.0 g/L）為氮源進行BC 發(fā)酵培養(yǎng)，監(jiān)測發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH 和BC 產(chǎn)量，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中pH 值和BC 產(chǎn)量的變化Fig.5 Changes in the pH-value and BC output of different medium in the fermentation

由圖5 可知，在發(fā)酵生產(chǎn)BC 的全過程中，蛋白質(zhì)和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基和玉米漿干粉含量為30.0 g/L培養(yǎng)基的pH 均呈現(xiàn)降低趨勢，偏離了木葡糖酸醋桿菌Gyll 發(fā)酵培養(yǎng)最適宜的pH 范圍。但是含量大于40.0 g/L 的玉米漿干粉培養(yǎng)基的pH 先是有所下降，然后又上升，基本恢復(fù)至5.5～6.0 左右。在該pH 范圍內(nèi)，較適宜木葡糖酸醋桿菌Gyll 的生產(chǎn)，從而增加BC 的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

1）當玉米漿干粉添加量≥50.0 g/L 時，純?nèi)芤旱木彌_指數(shù)（β）值均大于0.02，說明該溶液具有很強的緩沖能力。

2）當玉米漿干粉添加量≥40.0 g/L 時，發(fā)酵培養(yǎng)基的β 值均大于0.02，說明該玉米漿干粉發(fā)酵培養(yǎng)基具有很強的緩沖能力；

3）以玉米漿干粉為氮源的發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基pH 可維持在木葡糖酸醋桿菌Gyll的適宜生長范圍內(nèi)，而有助于提高BC 的產(chǎn)量。

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