黃芪蟲藤飲對Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎作用及ESR、RF的影響

廖亮英，李 點*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

黃芪蟲藤飲對Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎作用及ESR、RF的影響

廖亮英，李 點*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察黃芪蟲藤飲對Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis,CIA）大鼠的抗炎作用及對大鼠血清血沉（ESR）、類風(fēng)濕因子（RF）的影響，進(jìn)一步探討該藥的作用機(jī)制。方法 將 80只SD大鼠隨機(jī)分為空白組 10只，其余建立大鼠CIA模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨喋呤組、正清風(fēng)痛寧組、黃芪蟲藤飲高、中、低劑量組（下簡稱高、中、低劑量組）各組10只，分別給藥，觀察各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthrits,AI）積分，踝關(guān)節(jié)病理切片變化，取大鼠血清檢測ESR、RF含量。結(jié)果 AI積分在給藥2、3、4周后，各給藥組大鼠與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），其中各時間點中、低劑量組與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；給藥2、3周后高劑量組與正清風(fēng)痛寧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各給藥組與模型組比較，ESR、RF的含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），中、低劑量組與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；高劑量組RF含量下降比甲氨喋呤組、正清風(fēng)痛寧組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 黃芪蟲藤飲可降低CIA大鼠關(guān)節(jié)癥狀評分，抑制血清ESR、RF升高，對CIA大鼠具有較好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎；黃芪蟲藤飲；大鼠

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[1]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑等治療，但并不能有效地阻斷病變發(fā)展，且長期使用有明顯毒副作用。湖南中醫(yī)藥大學(xué)熊繼柏教授以黃芪蟲藤飲自擬方辨治本病，在臨床取得顯著療效，在此基礎(chǔ)上我們通過采用不同劑量組的黃芪蟲藤飲給藥，研究該藥治療Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的作用及機(jī)制，現(xiàn)將方法與結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠80只，♀♂各半，體質(zhì)量(100±20)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)批號：SCXK（湘）2011-0003，所有動物SPF實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.1.2 藥物與試劑 （1）藥物 黃芪蟲藤飲以黃芪、海風(fēng)藤、絡(luò)石藤、僵蠶、甘草等中藥組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。（2）試劑 Ⅱ型膠原蛋白（Collagen Ⅱ），弗氏不完全佐劑（IFA），美國Sigma公司產(chǎn)品；正清風(fēng)痛寧緩釋片由湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號1303102；甲氨喋呤片由上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號120101；大鼠類風(fēng)濕因子（RF）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒，美國RDelisa Kit產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 MK3酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品）；Finesse325石蠟切片機(jī)（英國珊頓公司產(chǎn)品）；BX43奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司產(chǎn)品）；TS-12A生物組織自動脫水機(jī)、BM-V3生物組織包埋機(jī)（均為孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 將實驗用黃芪蟲藤飲按照傳統(tǒng)方法煎煮2次，第1次加水10倍量，煎煮2 h，第2次加水8倍量，煎煮1.5 h，合并2次煎液，濃縮至所需濃度，4℃冷藏保存，備用。正清風(fēng)痛寧緩釋片、甲氨喋呤片分別于給藥時研成粉末加蒸餾水調(diào)配成溶液，用于灌胃。

1.2.2 分組與給藥 所有動物稱體質(zhì)量、編號后，隨機(jī)抽取10只（♀♂各半）作為空白組，其余動物進(jìn)行造模。在實驗第4周，再將造模大鼠按關(guān)節(jié)炎癥程度、體質(zhì)量分層，隨機(jī)分為6組即模型組、甲氨喋呤組（0.0009 g/kg）、正清風(fēng)痛寧組（0.0216 g/kg）、黃芪蟲藤飲高劑量組（簡稱高劑量組19.98 g/kg）、黃芪蟲藤飲中劑量組（簡稱中劑量組9.99 g/kg）、黃芪蟲藤飲低劑量組（簡稱低劑量組5 g/kg），每組10只。實驗第5周開始定時灌胃治療，甲氨喋呤組給予甲氨喋呤片混懸液灌胃，每周1次；正清風(fēng)痛寧組給予正清風(fēng)痛寧緩釋片混懸液灌胃，1次∕d；高、中、低劑量組動物給予黃芪蟲藤飲湯藥灌胃，1次∕d；空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，根據(jù)臨床人用劑量，按照動物與人體表面積折算公式，轉(zhuǎn)化為大鼠給藥等效劑量，大鼠給藥體積均為10 mL/(kg·d)，連續(xù)用藥4周。

1.2.3 Ⅱ型CIA模型的建立[2-3]用0.5 mol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2 mg/mL，4℃，過夜)，再與等量的IFA混合，于冰浴中充分乳化。用生理鹽水配置2%戊巴比妥鈉麻醉劑，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉。用手術(shù)剪剪掉尾根部皮毛，75%酒精消毒。取乳化后大鼠CIA造模劑，除空白組外，按0.2 mL/只于大鼠尾根部、背部、右后肢足趾多點皮內(nèi)注射，見到局部圓形皮丘腫起，為注射成功。造模后第7天按原方法注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mL/只做加強(qiáng)免疫1次?？瞻捉M注射等體積的生理鹽水進(jìn)行處理。將關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）作為判斷模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)，造模組每只大鼠AI＞5分為造模成功，造模成功率約為90%。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 一般情況評價 初次免疫前稱體質(zhì)量1次，初次免疫后每周稱1次，記錄大鼠一般情況并仔細(xì)觀察其毛色、活動狀態(tài)及關(guān)節(jié)腫脹變化。

1.3.2 關(guān)節(jié)癥狀評分 采用AI積分法。AI是反映關(guān)節(jié)炎發(fā)生與發(fā)展的一個重要客觀指標(biāo)，AI計算參照文獻(xiàn)[4]，根據(jù)關(guān)節(jié)炎發(fā)病大鼠的關(guān)節(jié)紅腫程度、范圍、關(guān)節(jié)腫大和變形情況，按0～Ⅳ級進(jìn)行評分。0級：關(guān)節(jié)無紅腫；Ⅰ級：個別趾關(guān)節(jié)稍發(fā)紅、腫脹；Ⅱ級：大部分足趾關(guān)節(jié)及足底腫脹；Ⅲ級：踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；Ⅳ級：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，AI值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級評分之和（1級為1分，總分為16分），造模組每只大鼠AI＞5分認(rèn)為造模成功。

1.3.3 大鼠血清中血沉（ESR）、RF的檢測 于末次給藥后24 h麻醉取血檢測大鼠血清中ESR、RF的含量，其中RF按照試劑盒采用ELISA測定。采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

1.3.4 病理組織學(xué)檢測 用藥4周后每組各取3只大鼠進(jìn)行踝關(guān)節(jié)病理切片觀察，觀察各給藥組及模型組對CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理改變的影響。取材部位為大鼠右后足踝關(guān)節(jié)，在10%中性甲醛溶液中固定24 h，5%硝酸脫鈣5 d，5%硫酸鈉液中和24 h，水洗12 h 后，脫水石蠟包埋，切片 5～6 μm(縱切)，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素伊紅染色(Henatoxylin-Eosin stain，HE)，中性樹脂封片，在光鏡下觀察其病理學(xué)改變。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以“”表示，多組比較采用方差分析，前后比較用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗，方差不齊者進(jìn)行秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

實驗日常觀察中，空白組大鼠狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量增加。造模后各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫、體毛色澤灰暗、食欲下降、活動量減少。給藥2周后，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀減輕，食欲好轉(zhuǎn)，毛發(fā)恢復(fù)光滑，體質(zhì)量均持續(xù)增長。

2.2 黃芪蟲藤飲對CIA大鼠AI積分的影響

實驗結(jié)果顯示各組大鼠足趾關(guān)節(jié)于造模后7～9 d開始出現(xiàn)不同程度的發(fā)紅、腫脹，模型組大鼠AI積分與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明造模成功；在給藥1周后，各給藥組大鼠AI積分與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；給藥2～4周后各給藥組大鼠AI積分與模型組比較有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）， 其中各時間點中劑量組、低劑量組大鼠AI積分改善程度與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或 P＜0.01）；在給藥 2～3 周后高劑量組與正清風(fēng)痛寧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；給藥4周后低劑量組與甲氨喋呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表 1。

2.3 黃芪蟲藤飲對大鼠血清ESR、RF含量的影響

實驗結(jié)果顯示：模型組與空白組比較，ESR、RF含量顯著升高（P＜0.01），表明造模成功；各給藥組與模型組比較，ESR、RF含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中中劑量組、低劑量組 ESR、RF 含量下降與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；高劑量組與甲氨喋呤組、正清風(fēng)痛寧組比較，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表1 黃芪蟲藤飲對CIA大鼠AI積分影響的比較表 （，n=10，分）

表1 黃芪蟲藤飲對CIA大鼠AI積分影響的比較表 （，n=10，分）

注：與空白組比較△△P<0.01；與模型組比較★P<0.05，★★P<0.01；與甲氨喋呤組比較■■P<0.01；與正清風(fēng)痛寧組比較*P<0.05，**P<0.01；與高劑量組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01。表2同。

給藥劑量g/(kg·d)組別空白組模型組甲氨喋呤組正清風(fēng)痛寧組高劑量組中劑量組低劑量組- -0.0009 0.0216 19.98 9.99 5.00給藥1周0.00±0.00 8.21±0.77△△8.19±0.56 8.15±0.40 7.99±0.32 8.02±0.36 8.37±0.29給藥2周 給藥3周0.00±0.00 8.15±0.80△△7.27±0.71★7.42±0.32★7.11±0.29★★*7.49±0.27★▲▲7.55±0.31★▲▲0.00±0.00 8.10±0.74△△6.03±0.20★★6.23±0.35★★5.93±0.21★★*6.15±0.29★★6.27±0.38★★▲給藥4周0.00±0.00 7.31±0.72△△4.49±0.27★★4.69±0.20★★4.41±0.30★★4.77±0.43★★▲4.94±0.35★★■■▲▲

表2 黃芪蟲藤飲對大鼠血清ESR、RF含量的影響（，n=10）

表2 黃芪蟲藤飲對大鼠血清ESR、RF含量的影響（，n=10）

組別空白組模型組甲氨喋呤組正清風(fēng)痛寧組高劑量組中劑量組低劑量組給藥劑量 g/（kg·d）--0.0009 0.0216 19.98 9.99 5.00 ESR（mm／h）0.80±1.13 13.19±2.57△△4.80±1.79★★5.10±1.21★★4.46±0.82★★5.93±0.87★★▲▲6.02±0.98★★▲▲RF（pg/mL）26.38±3.25 83.18±10.14△△49.77±11.65★★51.86±7.64★★32.79±5.78★★■■**41.87±6.34★★▲▲**47.63±5.92★★▲▲

2.4 黃芪蟲藤飲對大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變的影響

在光鏡下檢測，空白組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面平整，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組滑膜內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤和毛細(xì)血管增生；各治療組光鏡下病理改變較模型組減輕，甲氨喋呤組、高劑量組滑膜基本恢復(fù)正常，滑膜下結(jié)締組織可見少量炎性細(xì)胞，其中高劑量組較甲氨喋呤組改善明顯；正清風(fēng)痛寧組、中劑量組、低劑量組滑膜內(nèi)可見較多炎性細(xì)胞浸潤，滑膜上皮不完整，滑膜腔可見分泌物。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)改變的病理學(xué)光鏡圖（HE，×200）

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可歸屬中醫(yī) “痹證”、“尪痹”范疇[5]，中醫(yī)認(rèn)為，風(fēng)、寒、濕、熱邪氣，閉阻經(jīng)絡(luò)，阻滯氣血，“不通則痛”，為其主要病機(jī)，臨床以祛風(fēng)、散寒、除濕、清熱及通經(jīng)活絡(luò)為治則，可采用內(nèi)服、外治、針灸等方法綜合治療。

黃芪蟲藤飲為湖南中醫(yī)藥大學(xué)熊繼柏教授的自創(chuàng)方，由黃芪、海風(fēng)藤、絡(luò)石藤、僵蠶、甘草等組成，方中以黃芪為君藥，“氣行則血行”，取其益氣通絡(luò)之用；以僵蠶等蟲類藥，深入經(jīng)絡(luò)驅(qū)邪外出，搜風(fēng)剔絡(luò)驅(qū)邪、止痛；以海風(fēng)藤、絡(luò)石藤通利關(guān)節(jié)，祛瘀生新，流利經(jīng)脈，共為臣藥；再加甘草為使，調(diào)和諸藥且解藥中之毒，全方共成補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之劑。

Ⅱ型CIA模型是Trentham等1977年建立的實驗關(guān)節(jié)炎動物模型[6]，該模型能顯示出RA的慢性病變特征，如關(guān)節(jié)滑膜增生、軟骨和骨破壞，關(guān)節(jié)功能障礙。RF是直接作用于免疫球蛋白分子FC片段中抗原決定族的自身抗體，是人們認(rèn)識RA的一種免疫性疾病的早期證據(jù)之一。ESR是常用于RA檢測的炎癥指標(biāo)之一，反映了RA的急性期病理活動情況，與RF同為主要的實驗室檢測指標(biāo)。為進(jìn)一步研究黃芪蟲藤飲對實驗性RA大鼠的作用，本實驗成功復(fù)制了CIA大鼠模型，病理檢測結(jié)果顯示，模型組病理損害嚴(yán)重，表現(xiàn)在炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管增生，和空白組對比，明顯符合CIA的基本病理表現(xiàn)。黃芪蟲藤飲高劑量組和甲氨喋呤組炎性細(xì)胞的浸潤程度最低，表明黃芪蟲藤飲高劑量組和甲氨喋呤組對炎性細(xì)胞浸潤的抑制作用顯著。

從AI積分結(jié)果分析，給藥2～4周后各給藥組大鼠AI積分與模型組比較有所改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或 P＜0.01），其中各時間點中劑量組、低劑量組大鼠AI積分改善程度與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或 P＜0.01），表明在黃芪蟲藤飲的量效關(guān)系中，高劑量組作用優(yōu)于中劑量組和低劑量組；在給藥2～3周后高劑量組與正清風(fēng)痛寧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明高劑量組改善關(guān)節(jié)炎的作用與正清風(fēng)痛寧組相比，較有優(yōu)勢。各給藥組大鼠血清ESR、RF含量與模型組比較呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中劑量組、低劑量組 ESR、RF 含量下降與高劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明黃芪蟲藤飲具有抑制CIA大鼠血清ESR、RF升高的作用，且其作用與劑量有關(guān)，以高劑量作用顯著；高劑量組RF含量降低比甲氨喋呤組、正清風(fēng)痛寧組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明高劑量組對RF含量的影響作用較優(yōu)于甲氨喋呤組、正清風(fēng)痛寧組。本實驗研究證明了中藥復(fù)方黃芪蟲藤飲可降低CIA大鼠關(guān)節(jié)癥狀評分，抑制血清ESR、RF升高，對Ⅱ型CIA具有較好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，為臨床上運用和進(jìn)一步研究黃芪蟲藤飲治療RA提供了實驗依據(jù)。

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[2]彭 成.中醫(yī)藥動物實驗方法學(xué) [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008，560.

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（本文編輯 徐愛良）

Anti-inflammatory Effects of Astragalus Bug Cane Drink on Rats of TypeⅡCollagen-induced Arthritis and Effects on ESR and RF

LIAO Liangying,LI Dian*
（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To observe the anti-inflammatory effects of Astragalus bug cane drink on typeⅡcollagen-induced arthritis(CIA)rats and the effects on serum erythrocyte sedimentation rate(ESR)and rheumatoid factor(RF),to further explore the mechanism of action of the drug.Methods SD rats were divided into control group(n=10),and CIA rats,CIA rats were then randomly divided into model group,methotrexate group,Zhengqingfengtongning group,Astragalus bug cane drink high,medium and low dose group(hereinafter referred to as high,medium and low dose group).Arthritis index(AI),serum ESR and RF were evaluated;pathological changes of ankle joints were examined.Results AI of treatment groups was significantly different from CIA model group in 2,3,4 weeks,AI of low-dose groupand medium-dose group at each time point was significantly different from high-dose group(P<0.05 or P<0.01).AI of high-dose group was significantly different from Zhengqingfengtongning group after treating 2 to 3 weeks.(P<0.05).ESR and RF of treatment group was significantly lower in treat mentgroupscompared with the modelgroup(P<0.01),the difference oflow-dose group and medium-dose group compared with the high-dose group was statistically significant(P<0.01).RF was significantly reduced with high-dose group than MTX group and Zhengqingfengtongning group(P<0.01),high-dose group was superior to the methotrexate group and Zhengqingfengtongning groups.Conclusion Astragalus bug cane drink can reduce joint symptoms score,suppress the elevation of serum ESR and RF in typeⅡ collagen-induced arthritis rats,with anti-inflammatory and immunomodulatory effects.

rheumatoid arthritis;type Ⅱ collagen-induced arthritis;Astragalus bug cane drink;SD rats

R285.5;R743.33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.005.018.04

2013－10－27

湖南省科技廳科技計劃資助項目（2012SK3140）。

廖亮英，女，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：風(fēng)濕性疾病的中醫(yī)藥防治研究。

*李 點，女，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：1103968933@qq.com。