丹龍醒腦方對局灶性腦缺血大鼠CA1區(qū)Nestin和GFAP表達的影響

韋琛靜 ，周小青 *，劉旺華 ，李 花 ，謝夢洲 ，張利美 ，李路迢

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208）

丹龍醒腦方對局灶性腦缺血大鼠CA1區(qū)Nestin和GFAP表達的影響

韋琛靜1，周小青1*，劉旺華1，李 花2，謝夢洲1，張利美1，李路迢1

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，湖南 長沙 410208）

目的 探討丹龍醒腦方對大鼠腦缺血損傷后海馬CA1區(qū)巢蛋白（Nestin）和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達的影響。 方法 將48只大鼠隨機分為假手術組、模型組、依達拉奉組、丹龍醒腦方組。采用大腦中動脈線栓法制備大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO)模型，對大鼠進行神經功能缺損評分，采用HE染色觀察海馬CA1區(qū)細胞的形態(tài)學改變，采用免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)Nestin蛋白和GFAP蛋白的表達。結果 與假手術組比較，模型組治療3 d后和7 d后的神經功能缺損評分明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組和丹龍醒腦方組治療3 d后和7 d后的神經功能缺損評分明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；丹龍醒腦方組在治療3 d和7 d后Nestin蛋白的平均光密度增加(P<0.05)，GFAP蛋白的平均灰度值減少(P<0.05)。結論 丹龍醒腦方對海馬CA1區(qū)病理形態(tài)有保護作用。丹龍醒腦方抗腦缺血損傷可能與促進海馬區(qū)神經細胞增殖和分化有關。

腦缺血再灌注；丹龍醒腦方；巢蛋白；膠質纖維酸性蛋白；海馬CA1區(qū)

缺血性腦血管病嚴重危害著人類的健康和患者的生活質量，其死亡率和致殘率均居高不下。缺血性腦損傷后可促使神經細胞增殖、遷移和分化，而分化的新生神經元能部分替代和修復受損神經元，在一定程度上能改善神經功能缺損，參與神經再生和腦組織功能的恢復[1]。巢蛋白（Nestin）是神經干細胞所表達的一種特異性標志物，Nestin蛋白的表達水平可以作為神經干細胞發(fā)生的敏感性標志之一[2]。在中樞神經系統(tǒng)中，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形膠質細胞特異性活化的標志蛋白[3],而星形膠質細胞是保持神經元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要細胞。以往的研究表明丹龍醒腦方可增加血腦屏障的通透性，能減輕腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)損傷[4]。但是否是通過促進CA1區(qū)Nestin蛋白和GFAP蛋白表達促進神經再生，值得進一步研究。

1 材料和方法

1.1 藥物

丹龍醒腦方由丹參15 g，三七12 g，地龍6 g，石菖蒲 12 g，遠志 15 g，菟絲子 12 g，淫羊藿 10 g等組成。飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。依達拉奉注射液（國瑞藥業(yè)有限公司，批號：02-131102），規(guī)格 20 mL∶30 mg。 丹龍醒腦方飲片浸泡30 min，加水煎2次。頭煎加6倍水，沸后文火慢煎40～60 min；二煎加4倍水，沸后文火慢煎 30～40 min，合并2次煎液，濾過，水浴濃縮為含生藥1.0 g/mL，滅菌分裝，4℃ 冰箱冷藏。

1.2 主要試劑和儀器

多聚甲醛（批號：P1010）、Nestin兔抗大鼠抗體（批號：BA1289）、GFAP兔抗大鼠抗體（批號：BA0056）、二抗為山羊抗兔 IgG（批號：K136907E），均為北京中杉金橋生產；辣根酶標記、DAB顯色劑，均購自武漢博士德生物有限公司。AO-820切片機（產地美國）；DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏醫(yī)療儀器廠）；光學顯微鏡(Motic國產)以及病理圖像分析軟件系統(tǒng)。

1.3 動物分組及給藥

清潔級SD大鼠48只,雄性，體質量200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2011-0003。隨機分為2組，即假手術組（12只），實驗組（36只），實驗組用大腦中動脈栓塞再灌注法（大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模后，隨機分為模型組（12 只）、依達拉奉組（12只）、丹龍醒腦方組（12只）。假手術組除不插線外，余操作過程同MCAO。從手術后24 h開始給藥，劑量以70 kg成人為標準按體表面積換算，丹龍醒腦方組劑量為7.4 g/kg，灌胃給藥；依達拉奉組劑量為3.2 mg/kg，腹腔注射。假手術組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。以上各組每天灌胃1次，連續(xù)7 d。

1.4 動物模型制備和評估

根據(jù)改良Longa等[5]的方法，建立MCAO再灌注模型，缺血2 h,再灌注3、7 d。 參照Zea-Longa評分標準進行神經功能癥狀計分[5]：在大鼠術后24 h內進行評分：0分，無神經損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向對側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。神經功能缺損程度評分為1～3分的大鼠即為成功模型。

1.5 樣本采集與處理

給藥第3天和第7天給藥后4 h分兩次處死動物，每個時間點6只，在兩個相應的時間位點前，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后打開胸腔，在右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內迅速注入肝素化生理鹽水約200 mL。當右心耳流出液變清亮后，注入的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液約350 mL，灌流固定30 min后斷頭取腦，放入固定液中，脫水、透明、浸蠟。制作腦部冠狀切片。

1.6 免疫組織化學

按試劑盒說明操作，采用免疫組化PV9000法。切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加Nestin抗體、GFAP抗體，37℃孵育 2 h，PBS充分漂洗 2 min×3次，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加辣根酶標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，DAB顯色液室溫下顯色，蒸餾水沖洗，復染、脫水、透明、封片。用PBS代替Nestin抗體、GFAP抗體作陰性對照。在大鼠腦缺血CA1區(qū)同倍(×400)的6個不同視野，用病理圖像分析軟件系統(tǒng)分析統(tǒng)計每個視野下Nestin蛋白的平均光密度，GFAP蛋白的平均灰度值，分別取平均值。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠腦組海馬CA1區(qū)神經細胞HE染色的比較

假手術組腦組織海馬CA1區(qū)神經細胞層次分明，排列整齊，細胞核大而圓，胞漿染色均勻。模型組細胞數(shù)量減少，排列不齊，間隙增大，細胞核固縮濃染。依達拉奉組和丹龍醒腦方組比模型組細胞層次增多，仍可見少量細胞核固縮，胞漿染色變淺。見圖1。

圖1 腦組織海馬CA1區(qū)病理形態(tài)光鏡圖（HE染色×400）

2.2 各組大鼠神經功能缺損評分比較

與假手術組比，模型組在第3天、第7天的神經功能缺損評分均明顯升高(P<0.05)；與模型組比，丹龍醒腦方組與依達拉奉組在第3天、第7天的神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 大鼠神經功能缺損評分比較 （，n=6，分）

表1 大鼠神經功能缺損評分比較 （，n=6，分）

注：與假手術組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05。下表同。

組別 劑量3 d 7 d假手術組模型組依達拉奉組丹龍醒腦方組- -0 0 3.2 mg/kg 7.4 g/kg 2.75±0.13*2.55±0.12*#2.23±0.06*#2.44±0.12*2.16±0.10*#1.80±0.07*#

2.3 各組大鼠Nestin蛋白表達平均光密度值比較

與假手術組比較，治療3 d和7 d后其余各組Nestin的平均光密度值均增加，即陽性表達增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療3 d和7 d后依達拉奉組和丹龍醒腦方組Nestin的平均光密度值均增加，即陽性表達增加(P＜0.05)。結果見表2。

表2 大鼠CA1區(qū)Nestin平均光密度值的比較 （，n=6）

表2 大鼠CA1區(qū)Nestin平均光密度值的比較 （，n=6）

組別假手術組模型組依達拉奉組丹龍醒腦方組劑量- -3.2 mg/kg 7.4 g/kg 3 d 0.098±0.017 0.168±0.015*0.220±0.018*#0.228±0.017*#7 d 0.108±0.019 0.186±0.025*0.251±0.034*#0.256±0.030*#

2.4 各組大鼠GFAP蛋白的平均灰度值比較

與假手術組比較，治療3 d和7 d后其余各組GFAP蛋白的平均灰度值均減少，即陽性表達增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療3 d和7 d后依達拉奉組和丹龍醒腦方組的GFAP蛋白的平均灰度值減少，即陽性表達增加(P＜0.05)。結果見表3。

表3 大鼠CA1區(qū)GFAP平均灰度值表達量的比較（，n=6）

表3 大鼠CA1區(qū)GFAP平均灰度值表達量的比較（，n=6）

組別假手術組模型組依達拉奉組丹龍醒腦方組劑量- -3.2 mg/kg 7.4 g/kg 3 d 177±8.84 153±10.91*131±17.58*#122±13.97*#7 d 174±9.54 143±11.03*124±12.88*#117±10.65*#

3 討論

缺血性腦血管病其死亡率和致殘率一直居高不下，所造成的神經功能缺失為研究的難點，中樞神經系統(tǒng)神經元可再生被發(fā)現(xiàn)后，腦缺血后神經干細胞的增殖、分化方面的研究成為當前神經科學領域研究的熱點。研究表明，哺乳動物中樞神經系統(tǒng)有產生新神經元和修復受損區(qū)的能力，中樞神經系統(tǒng)具有的這種能力與腦內的神經干細胞是分不開的。正常情況下,神經干細胞以靜止、不增殖狀態(tài)而存在。腦缺血時在海馬齒狀回及側腦室室管膜下區(qū)等處存在具有多向分化潛能的神經干細胞[6]。神經干細胞開始增多，表明與神經細胞的修復有關[7]。

Nestin是神經干細胞所表達的一種特異性標志物，在神經系統(tǒng)發(fā)育的過程中，作為神經干細胞的標記蛋白參與神經再生和促進腦組織功能的恢復[8]。Nestin的表達水平具有特異性和階段性，在病理情況下，受損腦組織神經上皮干細胞蛋白的Nestin表達水平，可以作為神經干細胞發(fā)生水平的敏感性標志之一[9]。 有研究證明腦缺血后Nestin表達呈單峰變化趨勢，從1 d時開始增加，7 d達一小高峰[10]。本實驗大鼠腦缺血3 d和7 d后，腦組織CA1可見到Nestin蛋白陽性細胞的表達，與文獻報道[11]一致。

GFAP是星形膠質細胞特異性活化的標志蛋白?；罨男切文z質細胞對于保持神經元微環(huán)境的穩(wěn)定及神經元的正常功能具有重要意義，是保持神經元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要細胞，能改變神經元微環(huán)境并對其進行調節(jié)[3]。膠質細胞不僅給神經元提供營養(yǎng)代謝的支持，而且在腦缺血等神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中起著至關重要的作用[12]。研究表明，腦缺血后,GFAP表達在缺血側皮質，紋狀體，海馬區(qū)域有表達升高[8]。胡氏[13]研究表明，益氣活血方能促進腦缺血后GFAP表達升高，能促進腦缺血后神經細胞軸突的再生,促進腦卒中后神經功能的恢復。本實驗腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)中樞神經系統(tǒng)損傷時，GFAP表達呈現(xiàn)上調趨勢，從缺血后3 d開始，GFAP增多，第7天達到峰值，與以往研究[14-15]相似。

丹龍醒腦方以丹參為君，輔以三七、遠志、石菖蒲為臣，以地龍、淫羊藿、菟絲子為佐使。丹參、三七、地龍三者配伍，可以活血化瘀，通利經絡，相輔相成，相得益彰，使其活血通絡之力加倍。瘀阻腦絡，氣機不利，津停液阻，化濁為痰，痰由瘀生，痰瘀互結，配伍遠志、石菖蒲，得以化痰開竅。配伍淫羊藿、菟絲子，得以溫陽化氣，并推動血行，助血脈流通，表明丹龍醒腦方能促進海馬CA1區(qū)Nestin蛋白和GFAP蛋白的表達，可能通過促進神經干細胞增殖、分化，促進神經再生，改善神經功能。現(xiàn)代藥理學研究表明,丹參酮ⅡA[16]能提高腦組織的抗氧化能力，減輕大腦神經元的損傷；地龍[17]能夠提高腦缺血再灌注腦組織酶的活性，有效降低各種自由基、炎性細胞因子水平，發(fā)揮著抗炎、抗損傷作用；三七總皂苷[18]能促進腦缺血大鼠腦組織GFAP的表達增加。這可能是丹龍醒腦方促進神經干細胞增殖、分化的物質基礎，其具體機制有待進一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Expression of Danlongxingnao Recipe on Nestin Protein and GFAP Protein in Rats CA1 Area after Focal Cerebral Ischemia

WEI Chenjing1,ZHOU Xiaoqing1*,LIU Wanghua1,LI Hua2,XIE Mengzhou1,ZHANG Limei1,LI Lutiao1.
（1 Research Institute for Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medcine，Changsha,Hunan 410007,China;2 School of Traditional Chinese Medicine,HUCM,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective Explore the influence of Danlongxingnao recipe on expression of Nest in protein and GFAP protein in rats CA1 area after focal cerebral is chemia/reperfusion.Methods The 48 rats were randomly divided into sham-operation group,modelling group,Danlongxingnao recipe group and edaravone group.The modle of cerebral is chemia reperfusion（I/R）was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)and recanalization.Neurological symptom score wereevaluated.HE staining of the cells was used to observe the morphology changes in hippocampus CA1 area.Nestin protein and GFAP Protein were observed by immunohistochemical method in CA1 area.Results Compared with sham-operation,neurological symptom score of model group were increased and the result was significant(P＜0.05)after 3d and 7d treatment.Compared with modelgroup,neurologicalsymptom score ofDanlongxingnao recipe group and edaravone group were decreased and the result was significant(P＜0.05)after 3d and 7d treatment.The expression of average optital density of Nestin protein in Danlongxingnao recipe increased after 3d and 7d treatment(P＜0.05)and the expressions of average gradation of GFAP protein in Danlongxingnao recipe decreased after 3d and 7d treatment(P＜0.05).Conclusion The Danlongxingnao recipe had protective effects on the pathological morphological changing in hippocampus CA1 area.Danlongxingnao recipe can make effects after focal cerebral ischemia/reperfusion and it may be associated with promoting the proliferation and differentiation of neural stem cells.

Focal cerebral is chemia/reperfusion； danlongxingnao recipe； Nestin； glial fibrillary acidic protein； hippocampus CA1 area；

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.003.009.05

2014－03－24

國家自然科學基金資助項目（81202632，81373702），教育部博士點基金資助項目（20124323120003），湖南省科技廳重點項目資助（2011FJ2013），湖南省自然科學基金資助（13JJ3097），湖南省教育廳科研項目資助（12B097）。

韋琛靜，女，在讀碩士研究生，主要從事中醫(yī)診斷學研究。

* 周小青，男，教授，博士研究生導師，E-mail：zxq5381@sohu.com