產(chǎn)角蛋白酶菌株D5培養(yǎng)條件的研究

花萬里 石繪陸 俞春山 任 俊 李治斌

寧夏中衛(wèi)山羊選育場(chǎng)，寧夏中衛(wèi)755006

角蛋白以動(dòng)物的毛發(fā)、羽毛、蹄等為主要形式存在于自然界中，一般情況下很難被降解，但作為角蛋白酶的專一性底物，可被其降解。微生物來源的角蛋白酶是目前酶領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，這類酶在醫(yī)藥、飼料、肥料、皮革、食品、紡織、日化等工業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境治理方面都有廣闊的應(yīng)用前景［1］。我國(guó)畜禽飼養(yǎng)與加工業(yè)規(guī)模很大，每年產(chǎn)生大量廢棄家禽羽毛。家禽羽毛的蛋白含量很高，而且富含動(dòng)物所需的多種必需氨基酸，但是家禽羽毛的角蛋白穩(wěn)定性非常強(qiáng)，很難被胃腸道內(nèi)的消化酶消化，所以沒有得到有效的利用。家禽屠宰場(chǎng)廢棄物的大量排放已經(jīng)給生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重的壓力［2］；同時(shí)，我國(guó)飼用蛋白質(zhì)資源不足。如能對(duì)羽毛等角蛋白類物質(zhì)加以利用，既可以避免環(huán)境污染又可以彌補(bǔ)飼用蛋白資源的不足。近年來，出現(xiàn)了利用高溫高壓降解和酸堿水解工藝生產(chǎn)的羽毛粉飼料，生產(chǎn)過程產(chǎn)生的廢水會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定污染；同時(shí)，此種羽毛粉飼料價(jià)格比較高，而且其中的一些氨基酸（即蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸）遭到破壞，不易消化，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高［3］。

利用微生物發(fā)酵的方法制備雞羽毛蛋白粉具有上述工藝無法比擬的優(yōu)勢(shì)［4］。首先，微生物發(fā)酵法制備雞羽毛蛋白粉工藝不需要高溫高壓，可減少能源的消耗；同時(shí)發(fā)酵過程只需要弱堿或中性環(huán)境，而且固體發(fā)酵模式可減少水資源的使用和污水的排放，這樣就能減輕對(duì)環(huán)境造成的壓力。這種工藝的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于羽毛粉或新鮮的羽毛被微生物菌體和角蛋白酶協(xié)同作用后，二硫鍵被還原［5］，角蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，羽毛蛋白變得易消化，且氨基酸不被破壞，最大程度地提高了雞羽毛蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［6－7］。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)角蛋白酶的研究處于篩選高產(chǎn)角蛋白酶菌株、對(duì)發(fā)酵菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及酶蛋白的純化和生化性質(zhì)研究階段，沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用的報(bào)道。角蛋白酶酶活力的測(cè)定方法有多種，測(cè)定的底物不同，加之各文獻(xiàn)的測(cè)定條件也不盡相同，因此，很難比較不同研究者的研究水平。在國(guó)外，目前以地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）PWD1生產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵試驗(yàn)研究已達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，并獲得了德國(guó)生物技術(shù)研究所（BRI）的生產(chǎn)許可，生產(chǎn)商品名為Versazyme的角蛋白酶商品，2006年開始投入市場(chǎng)［8－9］。本試驗(yàn)通過測(cè)定不同影響因素條件下角蛋白酶的酶活力，確定了產(chǎn)角蛋白酶菌株D5的最佳培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種選擇

取中衛(wèi)市某養(yǎng)雞場(chǎng)處土樣，經(jīng)過多次分離純化，獲得1株能高效降解羽毛角蛋白的細(xì)菌D5。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2013年6月在寧夏中衛(wèi)山羊選育場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室和寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

牛肉膏：0.50%；水解雞羽毛粉：5.00%；磷酸氫二鉀：0.05%；蛋白胨：0.50%；硫酸銨：0.05%；硫酸鎂：0.01%；氯化鋅：0.01%；pH 7.50。

1.4 氮源對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5%的新鮮雞羽毛粉、5%的水解雞羽毛粉、5%的膨化雞羽毛粉，其他組分不變，測(cè)定不同氮源條件下發(fā)酵液的酶活力。

1.5 新鮮雞羽毛粉對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度分別為2%、3%、4%、5%的新鮮雞羽毛粉，其他條件不變，測(cè)定不同濃度的新鮮雞羽毛粉下發(fā)酵液的酶活力。

1.6 葡萄糖對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的葡萄糖，其他條件不變，測(cè)定不同濃度的葡萄糖下發(fā)酵液的酶活力。

1.7 蛋白胨對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的蛋白胨，其他條件不變，測(cè)定不同濃度的蛋白胨下發(fā)酵液的酶活力。

1.8 Mg2＋對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入濃度分別為0.00%、0.01%、0.02%、0.04%的硫酸鎂，其他條件不變，測(cè)定不同濃度的Mg2＋下發(fā)酵液的酶活力。

1.9 起始pH值對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，測(cè)定不同pH 值下發(fā)酵液的酶活力。

1.10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D5產(chǎn)蛋白酶影響的測(cè)定

配制最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間分別為3、4、5d，其他條件不變，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下發(fā)酵液的酶活力。

1.11 角蛋白酶酶活力的測(cè)定

采用Folin－酚試劑法［9］，將各發(fā)酵液50℃水浴1h，以TCA作為空白對(duì)照液（不水?。?，其他步驟相同。在680nm波長(zhǎng)下測(cè)定各發(fā)酵液吸光度和空白對(duì)照液吸光度，根據(jù)公式“酶活＝（發(fā)酵液吸光度－空白對(duì)照液吸光度）×100×稀釋倍數(shù)”計(jì)算酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對(duì)酶活的影響

不同氮源條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 不同氮源對(duì)酶活的影響

由圖1可知，菌株利用水解雞羽毛粉的能力比利用其他氮源的能力強(qiáng)，酶活較高。因此，應(yīng)選擇水解雞羽毛粉作為D5的氮源。

2.2 不同濃度新鮮雞羽毛粉對(duì)酶活的影響

不同濃度新鮮雞羽毛粉條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度新鮮羽毛粉對(duì)酶活的影響

由圖2可知，菌株利用濃度為2%的新鮮雞羽毛粉的能力比其他濃度的新鮮雞羽毛粉能力強(qiáng)，酶活較高。因此，應(yīng)將2%的新鮮雞羽毛粉作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的濃度。

2.3 不同濃度葡萄糖對(duì)酶活的影響

不同濃度葡萄糖條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度葡萄糖對(duì)酶活的影響

由圖3可知，菌株利用濃度為2%的葡萄糖的能力比其他濃度的葡萄糖能力強(qiáng)，酶活較高。因此，應(yīng)將2%的葡萄糖作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的濃度。

2.4 不同濃度蛋白胨對(duì)酶活的影響

不同濃度蛋白胨條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度蛋白胨對(duì)酶活的影響

由圖4可知，菌株利用濃度為2%的蛋白胨的能力比其他濃度的蛋白胨能力強(qiáng)，酶活較高。因此，應(yīng)將2%的蛋白胨作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的濃度。

2.5 不同濃度Mg2＋對(duì)酶活的影響

不同濃度Mg2＋條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 不同濃度硫酸鎂對(duì)酶活的影響

由圖5可知，菌株利用濃度為0.04%的硫酸鎂的能力比其他濃度的硫酸鎂能力強(qiáng)，酶活較高。因此，應(yīng)將0.04%的Mg2＋作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的濃度。

2.6 不同起始pH值對(duì)酶活的影響

不同起始pH值條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 不同pH值對(duì)酶活的影響

由圖6可知，菌株在pH 6.5的條件下產(chǎn)酶的酶活最高。因此，應(yīng)將pH 6.5作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的pH值。

2.7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間條件下，發(fā)酵液酶活的測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

由圖7可知，菌株在培養(yǎng)第3天時(shí)產(chǎn)酶的酶活最高。因此，應(yīng)將培養(yǎng)3d作為菌株D5產(chǎn)酶的最適酶活的培養(yǎng)時(shí)間。

3 討 論

培養(yǎng)基的起始pH值、培養(yǎng)時(shí)間等培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的組成對(duì)菌株的生長(zhǎng)有很大的影響［10］。通過試驗(yàn)測(cè)定不同因素條件下的酶活，確定產(chǎn)角蛋白酶菌株D5的優(yōu)化培養(yǎng)基為：新鮮雞羽毛粉2.00%，酵母膏2.00%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸銨0.05%，蛋白胨2.00%，硫酸鎂0.04%，氯化鋅0.01%；優(yōu)化發(fā)酵條件為：溫度37 ℃，pH 6.5，裝量80 mL／250mL錐形瓶，轉(zhuǎn)速150r／min，培養(yǎng)時(shí)間3d。

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