原花青素HPLC測定方法研究進展

格日勒，亓 偉 *，劉淑娟

（1.銀川能源學院 石油化工學院，寧夏 銀川 750105；2.寧夏唐明制藥有限公司，寧夏 銀川 750011）

原花青素（procyanidins，PC）是植物王國中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱。起初統歸于縮合鞣質或黃烷醇類。隨著分離鑒定技術的提高和對此類物質的深入研究與深刻認識，現已成為一大類物質并稱之為原花青素。原花青素是由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成。最簡單的原花青素是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小，通常將二～四聚體稱為低聚體（oligomers procyanidolic，OPC），將五聚體以上的稱為高聚體（polymers procyanidolic，PPC）。

葡萄原花青素具有優(yōu)異的抗氧化性能和顯著的清除自由基能力，具有抗心血管疾病、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗炎、抗疲勞、改善視覺功能等藥理作用[1]。研究表明，原花青素的聚合度決定了其抗氧化活性的大小，對于聚合體來說，聚合度越高其抗氧化性越低[2]。從原花青素的分子結構來看，隨著聚合度（分子質量）的增加，分子極性降低。

由于原花青素組成的復雜性，要測定每一組分含量相對困難，因此，關于原花青素的測定方法至今還沒有一個統一的標準。在很長一段時間內主要采用的是紫外分光光度法[3]，香草醛-鹽酸法[4]、鐵鹽催化比色法[5]、正丁醇-鹽酸法[6]、高鐵鹽-鐵氰化鉀比色法[7]等。高錳酸鉀分光光度法[8]等。馬亞軍等[9]建立了硫酸高鈰銨分光光度法測定葡萄籽提取物中原花青素的方法，它是通過測定黃色高鈰鹽的吸光度值，間接測定原花青素。這些方法各有優(yōu)缺點，檢測成本也相對較低，但普便存在專屬性，準確度較低，靈敏度不夠理想，不能對某一特定的成分進行測定等問題。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是色譜法的一個重要分支，它的出現雖然不長，但這種分離分析技術的發(fā)展卻十分迅猛，應用十分廣泛，該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農業(yè)、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。由于高效液相色譜法的高選擇性，使得人們近年來開始研究用此法對葡萄籽（不僅僅是葡萄籽）原花青素進行測定。

從高效液相色譜法（HPLC）及其與其他方法的聯用等各種檢測方法的基本原理入手，對各種方法的研究領域進行總結。

1 HPLC法

HPLC法具有出色的分離和定量分析性能，其梯度洗脫功能及多種檢測器，尤其是紫外和陣列二極管檢測器，非常適合對酚類物質進行分析和檢測。從早期直到現在的HPLC法中，有很多較成功的實例，對葡萄籽、松樹、蘋果、山楂、草莓、樺樹等一系列植物提取物中原花青素（PC）進行了廣泛的研究，一般使用相應的單體和PC成分純品為外標，建立對各色譜峰逐一定量的分析方法。從原則上說這種方法較分光光度法只用一種參比物測定PC總含量的方法更加精密，結果的準確性較高。

馮建光等[10]根據原花青素聚合度越高，分子極性越小，在C18色譜柱上就吸附的越牢固，用流動相進行洗脫的時候則出峰的時間相對比較晚的原理。用HPLC法對葡萄籽提取物的OPC進行了定量檢測，為生產葡萄籽提取物的廠家提供了一個測定方法。楊大進等[11]用HPLC法測定了保健食品中原花青素進行含量測定。趙平等[12]采用AB-8型大孔吸附樹脂對原花青素進行分級純化，再采用高壓梯度洗脫的方法對原花青素進行測定。陳召桂等[13]同時用HPLC的指紋圖譜對葡萄籽提取物進行定性，并測定葡萄籽提取物中標志性成分原花青素B2的含量，彌補了其他方法不能對葡萄籽提取物做定性分析的不足，從而準確判斷葡萄籽提取的質量優(yōu)劣。

2 高效液相色譜-質譜法

高效液相色譜-質譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是通過樣品前處理得到原花青素粗提物，再利用高效液相色譜-質譜進行定性定量分析的方法。如將樣品在酸性條件下加熱水解，使原花青素C-C 鍵斷裂生成游離的花青素，再用高效液相色譜-質譜進行分析花青素成分，從而對樣品中原花青素物質進行定性、定量檢測。楊成對等[14]用HPLC-MS法對葡萄籽粗提物中的低聚原花青素的組成作了初步分析。對照原青花素結構，可以推測提取物的主要組分有6種為原花青素成分，分別為兩種單體（M=290）、兩種二聚體（M=578）、一種三聚體（M=866）和一種二聚單酯。

快速高分離度液相色譜（rapid resolution liquid chromatography，RRLC）與傳統HPLC相比，能耐受更高的壓力，可達60 MPa，分離度提高60%，速度提高20倍；最小延遲體積配置（120 μL）使其成為LC/MS在窄徑色譜柱應用方面的最佳支持，蘇葉萍等[15]采用快速高分離度液相色譜-串聯質譜（RRLC-MS/MS）法分離分析葡萄籽提取物中原花青素的成分。葡萄籽提取液經HPD400A大孔吸附樹脂純化后，采用RRLC-MS/MS 法分離，并根據質譜信息分析其化學成分，分離檢測出葡萄籽提取物中原花青素的3種單體，初步分離鑒定出9種二聚體、5種三聚體和1種四聚體，收到了較好的分離效果。

孫蕓等[16]用反相高效液相色譜-電噴霧質譜（reversed phase-high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrum，RP-HPLC/ESI-MS）法分析葡萄籽粗提物中低聚原花青素的組成。方法根據質譜的準分子離子EM-HI（m/z）檢測其單體及低聚體。結果初步檢測出3個單體、7個二聚體及3個三聚體。但由于各聚合體異構體數目繁多，其ESI質譜行為也很相近。除單體外，還未能對各異構體的結構進行準確的鑒定。

電噴霧質譜（ESI-MS）可以提供化合物的結構信息，可與液相色譜聯用，作為一種軟電離技術，可以根據產生的準分子離子直接定性。任其龍等[17]建立了采用液相色譜-電噴霧離子化-質譜聯用（liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrum，LC/ESI-MS）對葡萄籽提取物中的多種低聚原花青素進行分析鑒定的方法。在電噴霧電離負離子模式下采用選擇離子監(jiān)測模式（selective ion monitoring，SIM）將幾種低聚體進行了選擇性的分離。結果所檢葡萄籽提取物中共含有（＋）-兒茶素、（－）-表兒茶素和（－）-表兒茶素沒食子酸酯3種單體、8種非酯型和4種沒食子酸酯型共12種二聚體及4種非酯型三聚體等。

3 TLC-HPLC/MS法

薄層層析-高效液相色譜-質譜（thin layer chromatography-high performance liquid chromatography/mass spectrometry，TLC-HPLC/MS）法是通過薄層層析法處理得到原花青素粗提物，再利用高效液相色譜-質譜進行定性定量分析的方法。薄層層析法保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，混合物易分離，分辨力較強，根據原花青素各組分極性不同，對原花青素進行測定?？梢缘玫讲煌酆隙鹊脑ㄇ嗨?。呂麗爽等[18]采用乙酸乙酯萃取原花青素提取液，再用薄層層析法將不同的聚合度原花青素展開，展開劑為甲苯∶丙酮∶乙酸=3∶3∶1，得到3種組分，并通過HPLC及質譜鑒定為單體、二聚體及三聚體。

4 Folin-Ciocalteau法與HPLC結合

在堿性溶液中酚類化合物包括原花青素可以將鎢鉬酸還原（W6+變?yōu)閃5+），生成藍色化合物，顏色的深淺與酚的含量相關，在760nm波長處有最大吸收。此法測定的是試樣中總酚的含量，原花青素、低分子多酚、簡單酚、帶酚羥基的氨基酸及蛋白質和VC等易被氧化的物質均被測出，此法稱為福林酚（Folin-Ciocalteau，FC）試劑法，是在福林酚試劑中加入鋰鹽，克服福林酚試劑不穩(wěn)定的缺陷，較之更為靈敏，吸收峰也較窄，對酚的選擇性較高[19]。

由于按Folin-Ciocalteau 法測定的總多酚是以相當于沒食子酸表示的，所以葡萄籽提取物中兒茶素等單體按Folin-Ciocalteau法測定，并以沒食子酸的量表示時，不能反應其真實含量。這樣造成了按Folin-Ciocalteau法測定總多酚時反應出的葡萄籽提取物中的單體含量與HPLC 法測定的單體含量是存在差異的。因此葡萄籽提取物中原花青素的含量用總多酚的含量減出其中單體的含量必須有一個校正系數。這樣才能使Folin-Ciocalteau法和HPLC測定單體含量等同起來[20]。馮建光等[21]用高效液相色譜和Folin-Ciocalteau相結合的方法分析了葡萄籽提取物中原花青素的百分含量，并消除了蛋白質、氨基酸對結果測定產生的影響。

5 香草醛-鹽酸/硫酸法與HPLC結合

在原花青素測定法中，香草醛-鹽酸/硫酸法是較常用方法，其測定原理是原花青素在酸性條件下，A環(huán)的化學活性較高，其上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮合，產物在濃酸作用下形成有色的正碳離子，用分光光度法測其吸光度值，根據標準曲線來計算樣品中原花青素的含量，鹽酸和硫酸都可作為反應過程的催化劑[22]，該法主要測定的是黃烷-3-醇單體與原花青素的總量，測定步驟簡單，方法有著較高的精密度及準確度。向陽等[23]用香草醛鹽酸比色法測定葡萄皮和籽中的原花青素，其方法相對可靠。但是，香草醛法操作方式較多、差別比較大[24-26]，不利于使用者的選擇。鄭俊霞等[27]通過香草醛比色與HPLC法相結合，原花青素含量以黃烷-3-醇、原花青素總量減去HPLC法測定的黃烷-3-醇單體含量之差來代表，針對葡萄籽超微粉中主要成分進行了測定。

6 Porter-HPLC結合法

Porter 法又被稱為鐵鹽催化比色法，該方法具有較好的重現性和準確性。Porter-HPLC法是先將樣品用Porter 法進行處理，再進行HPLC分析的方法。原花青素易溶于水，將原花青素的單體或聚合體在加熱的酸性條件下經鐵鹽催化，使C-C 鍵斷裂生成深紅色花青素離子后，用HPLC 進行分析，根據保留時間進行定性分析，根據外標法進行定量分析[28]。Porter-HPLC結合法優(yōu)點在于使用HPLC法對花青素進行測定，從而除去供試液中共存的其他有色雜質的干擾，提高了方法的準確度。

7 硫解-HPLC結合法

芐硫醇可以與原花青素發(fā)生專一性的硫解反應，使其分子的基部生成一個黃烷醇分子，而上部的其余單元全部生成黃烷醇的4-芐硫醚衍生物，經這種硫解處理之后再進行HPLC分析，色譜圖變得十分簡單，通過測定和統計有限幾個色譜峰的面積即可計算原來樣品中原花青素成分的含量[29]。侯棟等[30]采用硫解-HPLC結合法快速檢測原花青素，研究純化了芐硫醚-表兒茶素和芐硫醚-表兒茶素沒食子酸酯，并與沒食子酸、兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯為對照品，在一定的色譜條件下，6 種硫解產物可在11 min 之內完成分離，外標法定量分析相對標準偏差均＜1.86%（n=5），最低檢出限為0.5～1.5 ng，線性關系良好（r≥0.999 6），平均回收率77.8%～94.6%，該方法具有良好的靈敏度、精密度和準確度。

8 小結

原花青素資源豐富，歷經30多年的研究、開發(fā)，由于其優(yōu)越的抗氧化活性，其在改善微循環(huán)、治療眼科疾病、藥物與化妝品等領域的應用均取得重大進展，近年來在很多國家都發(fā)展迅速，也預示了原花青素的廣闊發(fā)展前景。雖然研究原花青素的方法很多，但至今還沒有一個統一檢測方法對其進行定性、定量分析。

HPLC技術對原花青素組分進行分析鑒定有助于探索不同資源的原花青素的組分、結構及功能的關系，形成相關的評價體系，有力地推動原花青素的開發(fā)利用，高效液相色譜法及與其他方法的聯用可以同時對原花青素進行分離與分析，在原花青素的檢測上將發(fā)揮越來越重要的作用。

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